本发明专利技术涉及了一种适用于PCR扩增的真菌DNA提取方法，该方法是：将菌体经过液体培养，离心，收集菌丝体后；在研磨设备中加入TRIS饱和酚提取液研磨至糊状；将糊状物转入离心管中，加氯仿-异戊醇抽提液混匀抽提蛋白，离心，取上清液；上清液加无水乙醇沉淀，离心，收集沉淀物；沉淀物乙醇洗涤，干燥，溶解，即得真菌基因组DNA。本发明专利技术避免了使用液氮，减少了试剂的使用，具有简便、高效、快速和廉价的特点，能在短时间内完成对大量样品的提取。用此方法提取的DNA浓度和纯度理想，能满足后续的PCR扩增等常规分子生物学研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种分离、提取、纯化DNA的方法，尤其涉及一种适用于PCR扩增的真菌DNA提取方法。
技术介绍
随着分子生物学学科的发展，在真菌的分子生物学研究中，快速高效地提取质量优良的DNA有着重要意义。真菌具有特殊的细胞壁结构，与其他微生物相比，其细胞壁厚， 多糖含量高，所以真菌DNA的提取较为困难。目前，常用的真菌DNA提取方法是CTAB法、 SDS法及试剂盒法。前两种方法的主要技术路线是利用液体或固体培养基培养真菌，收集菌丝，用液氮研磨破碎细胞壁，再利用各提取液提取DNA，经过纯化得DNA。通过这些方法一次可提取大量DNA而且质量较好，但以上这些方法有一定的缺点一是液氮容易冻伤皮肤，一些地方液氮和干冰不容易获得而受到限制；二是费时，效率不高；三是所用设备和药品相对较多。试剂盒法提取DNA效率高、质量好、操作简单，但是成本较高，不适合大规模使用，而且多数只适合小量制备。另外，现有的真菌DNA提取方法步骤大体相似，主要差别关键在于采用何种方法来打破细胞壁。常用的破壁方法主要有冷冻干燥研磨法、玻璃珠机械破壁法、微波法、酶解法和氯化苄法等。通常冷冻干燥研磨法多用液氮来处理，一般是直接在液氮中研磨；玻璃珠机械破壁法则加入硅胶、石英砂、玻璃珠等来帮助破壁；酶解法和氯化苄法是利用酶、氯化苄、尿素来溶解细胞壁。上述的破壁方法或存在着提取速度慢、或存在着步骤繁琐、或存在着技术要求高的不足。因而，急需探索一种简便快速、且费用和技术要求均较低的方法，以大量提取真菌DNA用于满足后续的PCR扩增等常规分子生物学研究的需求。
技术实现思路
为了克服现有技术中的不足，本专利技术提供一种快速、简便、经济、易行的适合PCR 扩增的真菌DNA提取方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是一种适合PCR扩增的真菌DNA提取方法，包括以下步骤a、培养真菌，离心，收集菌丝体；b、将所得到的菌丝体置于研磨设备中，加入TRIS饱和酚提取液，研磨至糊状；C、将所得到的糊状物转入离心管中，加氯仿-异戊醇抽提液混勻抽提蛋白，离心， 取上清液；d、将所得到的上清液加无水乙醇沉淀，离心，收集沉淀物；e、将所得到的沉淀物采用乙醇洗涤，干燥，溶解，即得。一种适合PCR扩增的真菌DNA提取方法，其具体步骤如下a、采用液体培养法培养真菌约36 72小时，控制转速为12000 15000r/min，离心5 lOmin，收集菌丝体；b、将步骤a所得到湿重为0. 2 0. 5g的菌丝体置于研钵，加入Iml的TRIS饱和酚提取液，研磨至糊状；其中，所述的TRIS饱和酚提取液的pH值为8. 0 ；C、将步骤b所得到的糊状物转入微量离心管中，加0.5ml的氯仿-异戊醇抽提液振荡混勻，抽提蛋白，其中氯仿-异戊醇抽提液的体积比25 1 ；控制转速为12000 15000r/min，离心5 lOmin，取上清液；d、将步骤c所得到的上清液转入新离心管中，加入2倍体积的预冷无水乙醇，混勻，-20°C放置1 2小时，控制转速为12000 15000r/min，离心5 lOmin，收集沉淀物；e、将步骤d所得到的沉淀物采用浓度为70 75%的乙醇漂洗2次后，控制转速为7500 12000r/min，离心处理3 5min，然后在超净工作台中鼓风干燥，加50 μ 1的无菌去离子水溶解，即得。上述的步骤c中将所得到的糊状物转入微量离心管是采用尖端剪除0. 5cm的吸头转入。本专利技术的提取真菌DNA的方法，具有以下优点(1)避免了使用液氮，解决了易冻伤皮肤的问题。并便于不易获得液氮的地方使用；(2)减少了试剂的使用，无需加入其他帮助破壁的裂解液，无需昂贵的仪器和试齐U，经济高效；(3)快速简便，整个提取过程中在1. 5-2个小时内即可完成。(4)该方法提取的DNA质量较好，适合作为PCR扩增的模板。因此，与其他常用的真菌DNA提取方法相比，本专利技术的提取真菌DNA的方法具有简便、高效、快速和廉价的特点，能在短时间内完成对大量样品的提取。用此方法提取的DNA 浓度和纯度理想，能满足后续的PCR扩增等常规分子生物学研究的要求，特别适合于基础条件一般的实验室使用。附图说明图1为采用本专利技术方法提取的3株真菌基因组DNA的琼脂糖凝胶(1% )电泳图。 其中泳道1为聚多曲霉(Aspergillus sydowii)；泳道2为附球孢菌(Epicoccum spp.)；泳道3为链格孢菌(Alternaria sp.)。图2为采用本专利技术方法提取的3株真菌DNA为模板，PCR扩增rDNA-ITS序列片段的琼脂糖凝胶电泳图。其中泳道M为Marker，分子量标准从上到下依次为2000、1600、 1000、750、500、250 ；其中泳道1为聚多曲霉(Aspergillus sydowii)；泳道2为附球孢菌 (Epicoccum spp.)；泳道 3 为链格抱菌(Alternaria sp.)。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明。实施例11、DNA 提取a、接种聚多曲霉(Aspergillus sydowii)于液体培养基，37°C培养36小时，然后在1. 5ml的离心管中，控制转速为12000r/min，离心lOmin，收集菌丝体；b、称取湿重为0. 2g菌丝体，置于洁净的研钵中，向研钵中加入Iml的TRIS饱和酚提取液，充分研磨至糊状；其中，所述的TRIS饱和酚提取液的pH值为8. 0 ；C、用尖端剪除0. 5cm的蓝色吸头将糊状物全部转移到1. 5ml的离心管中，充分振荡约lmin，随即加入0. 5ml的氯仿-异戊醇抽提液，其中氯仿_异戊醇抽提液的体积比 25 1，轻轻振荡混勻，抽提蛋白；控制转速为12000r/min，离心5min，取上清液;d、将上清液转入新离心管中，加入2倍体积的预冷无水乙醇，混勻，_20°C放置1小时，控制转速为12000r/min，离心lOmin，收集沉淀物；e、将沉淀物采用70%乙醇漂洗2次后，控制转速为7500r/min，离心处理5min，然后在超净工作台中鼓风干燥，加50μ 1的无菌去离子水溶解，即得。其琼脂糖凝胶电泳检测如图1所示。2. PCR 扩增用所提取的DNA作为模板，设计真菌ITS区基因引物ITS-5 (5 ‘-FGGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3，)和 ITS_4R(5 ‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，)，进行 PCR 扩增，成功扩增得到长度约为600bp的rDNA-ITS序列片段，如图2所示。实施例21.DNA 提取a、接种附球孢菌(Epicoccum spp.)于液体培养基，观°C培养72小时，然后在 1. 5ml的离心管中，控制转速为15000r/min，离心5min，收集菌丝体；b、称取湿重为0. 3g菌丝体，置于洁净的研钵中，向研钵中加入Iml的TRIS饱和酚提取液，充分研磨至糊状；其中，所述的TRIS饱和酚提取液的pH值为8. 0 ；C、用尖端剪除0. 5cm的蓝色吸头将糊状物全部转移到1. 5ml的离心管中，充分振荡约lmin，随即加入0. 5ml的氯仿-异戊醇抽提液，其中氯仿_异戊醇抽提液的体积比 25 1，轻轻振荡混勻，抽提蛋白；控制转速为15000r/min，离心8min，取上清本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贾爱荣，刘昌衡，孙永军，张永刚，孟秀梅，张绵松，胡炜，刘新，袁文鹏，夏雪奎，
申请(专利权)人：山东好当家海洋发展股份有限公司，山东省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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