本发明专利技术涉及一种抑制黑色素形成的ｓｉＲＮＡ及其制备方法以及在祛除黑色素方面的应用，内容包括：构建了可以在大肠杆菌中高效表达的与抑制黑色素形成有关的长双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）的表达载体ｐＥＴ－ＭＥＬⅢ；转化大肠杆菌在优化条件下大规模发酵生产长双链ＲＮＡ，每１００克菌体（湿重）可生产２０４毫克ｄｓＲＮＡ；均质机均质化破壁抽提ＲＮＡ，ＣＦ－１１树脂吸附纯化ｄｓＲＮＡ；利用大肠杆菌发酵制备的ＲＮａｓｅ Ⅲ对ｄｓＲＮＡ进行水解，得到１８－２５ｂｐ的ｓｉＲＮＡｓ；通过脂质体包埋ｓｉＲＮＡｓ；实际使用证明制备的ｓｉＲＮＡ具有明显祛除黑色素斑的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制剂
，具体涉及一种抑制黑色素生物合成的siRNA及其制备方法，以及siRNA在祛除黑色素中的应用。
技术介绍
(1)关于黑色素随着全球工业化的迅猛发展和环境的日益破坏，氟氯化合物剧增和臭氧层遭劫破坏，紫外线辐射增加，对人体造成了三种损伤皮肤发炎、皮肤老化、色素沉积，其中色素沉积是指皮肤局部或全部的细胞沉积大量黑色素。黑色素发生于黑素细胞中，是一种蛋白质衍生物，呈褐色或黑色，黑素细胞能够活跃合成黑色素生物合成所必需的酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白，它们能使酪氨酸氧化成多巴，井进一步氧化形成黑色素，完成黑素化过程。人体肤色与黑素体的数目、大小、分布及类型有直接的关系。皮肤颜色与黑色素合成的整个系统有密切的关系，在黑素细胞内合成黑色素并形成黑色体，黑素体以单一的颗粒或以复合聚集的形式将黑素颗粒复合体输送到角质细胞，黑色素在角质细胞内的降解或沉积。任何一个环节发生障碍均可导致皮肤颜色变化。黑色素的生成与酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白的合成及活性、酪氨酸和分子氧的浓度直接有关，其形成的速度和数量还常常受到下列因素的影响多巴、硫氢基、微量元素、内分泌因素(包括垂体分泌的垂体激素、肾上腺皮质激素、性激素、神经因素、甲状腺素、氨基酸及维生素)。酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白在黑色素的生物合成及其黑色素化的过程中起着极为重要的作用。通过RNA干扰的实现高效而专一性地干扰酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白基因的表达，从沉默酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白的活性，是抑制黑色素合成、改善皮肤颜色的有效途径。(2)关于RNA干扰技术RNA干扰(RNAi)指双链RNA(dsRNA)分子可以特异性地诱发与其同源序列的mRNA分子被降解，导致相应基因表达抑制的现象，是一种特殊的转录后的基因沉默(PTGS)现象。RNAi技术是基于RNAi现象而开发的抑制特定基因表达的分子生物学技术。最早有关RNAi现象的报道出现在1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的共抑制现象，以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了RNAi现象。1999年，Hamilton和Baulcombe在发生RNAi现象的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸的RNA片段，这些RNA片段被证明是RNAi所必需的，称为小分子干扰RNA(siRNA)。果蝇中的研究成果基本阐明了RNAi的机制，当长链的dsRNA进入细胞时，它被一种Dicer核酸水解酶所识别并被剪切成21-25nt的siRNA，双链的siRNA被RNA解链酶解链，以单链的形式与另一核酸水解酶结合形成RNA酶复合体，复合体中的单链RNA象向导一样引导酶复合体识别序列与之互补的mRNA并将其水解，从而特异性地抑制基因的翻译表达。在线虫和植物中，单链的siRNA除了起“向导”作用之外，还可作为聚合反应的引物。在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以mRNA为模板，单链的siRNA为引物合成互补链，使得单链的mRNA成为双链RNA，新合成的dsRNA则又被核酸酶剪切成siRNA。RdRP的作用使RNAi的信号得到放大，只要极微量的dsRNA就能引起强烈的基因表达抑制。RNAi高效而专一地抑制基因表达的特性首先在线虫功能基因组研究中得到广泛的应用。在哺乳动物细胞中，超过30bp的dsRNA会通过激活PKR系统和RNase L，导致翻译起始的抑制以及非特异的RNA降解，最终导致非特异性的基因表达抑制。这种机制阻碍了RNAi技术在哺乳动物细胞中的应用。Elbashir等人用人工合成的21nt的互补双链siRNA在多种哺乳动物细胞中诱发了RNAi机制，并避开了PKR系统和RNase L，专一性地抑制了目的基因的表达，表明RNAi技术可以成功被应用于哺乳动物。RNAi技术应用于哺乳动物的关键是制备siRNA。目前siRNA制备有多种方法化学合成法、细胞内表达法和体外转录长片段dsRNA后用大肠杆菌III型RNase或Dicer水解法等。但以上方法价格昂贵、不易操作和推广困难。基于经济性与实用性，本专利技术采用更为高效、简便、低成本的方法，利用大肠杆菌发酵大规模制备dsRNA，通过分离纯化和酶切制备siRNAs分子的方法，大量制备抑制黑色素形成的siRNAs。此专利技术可以在医药与化妆品领域中得到广泛应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种能够抑制黑色素形成的小分子干扰RNA(siRNA)及其制备方法，并提出siRNA在祛除黑色素中的应用。本专利技术提出的能够抑制黑色素形成的siRNA，从具有SEQ.ID.NO.1的核苷酸序列经转录获得的dsRNA经酶切获得。本专利技术制备上述siRNA的方法包括在大肠杆菌表达能够抑制黑色素合成的双链RNA(dsRNA)以及用酶切得到siRNA 2个步骤将黑色素生物合成关键酶的相关基因片段TYR、TRP1、TRP2重组后构建到表达有颈环结构双链RNA(dsRNA)的表达载体上，转化大肠杆菌后进行发酵，表达生产dsRNA；离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物，该抽提物用CF-11树脂进行吸附，洗去单链RNA和DNA分子，洗脱收集dsRNA部分，洗脱液通过酒精沉淀回收得到dsRNA(dsRNA的核苷酸序列由SEQ.ID.NO.1所示序列转录获得)；再以RNase III将长链的dsRNA切成18-25bp的siRNAs，除去RNase III，获得抑制黑色素生物合成的siRNAs。本专利技术将上述siRNA用于祛除黑色素的方法如下用卵磷脂等脂质对上述siRNAs进行脂质体包埋，制备siRNA脂质体用于祛除黑色素和色素斑。本专利技术在大肠杆菌中表达抑制黑色素合成的dsRNA，包括构建一种可在大肠杆菌中高效表达dsRNA的表达载体pET-MELIII(见图1、2)，该载体以pET-22b为出发质粒，基本构成元件包括正向序列A片段、反向重复序列B片段和第三片断段C片断，其中A、B片段由酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白三个基因TYR、TRP1、TRP2的片段重组而成。三个片段的基因序列见SEQ.ID.NO1。具体克隆流程见图3所示，其方法是将重组基因片段以相反的方向将5’端连接到间隔序列C片段的两侧，然后克隆到一个带有T7启动子的载体中去。表达载体转化到能表达T7 RNA聚合酶的宿主大肠杆菌后中，重组基因的正反两个方向的DNA片段以及两者之间的C片段被依次转录，成为一条连续的RNA链，生理条件下可以形成互补的长双链RNA。经优化发酵表达，100g湿重的大肠杆菌菌体可得到204mg的dsRNA样品。本专利技术中，重组基因的各重组元件分别通过PCR反应从人基因组DNA中获得，以特定限制性核酸内切酶酶切位点克隆为串联重组A片断(1kb)和与A片段互补而排列方向相反的B片段(1kb)。本专利技术中，以黑色素生物合成中的三个关键酶基因(TRP1、TRP2、TYR)为靶位，选择合适片段设计PCR引物，通过PCR扩增从人基因组DNA中获得相应的带有特定限制性酶切位点的DNA片段，以特定限制性酶切位点进行分子克隆，获得一个重组基因TYR-TRP1-TRP2，并构建为表达双链RNA的大肠杆菌表达载体pETMELIII。本专利技术中，发酵表达生产长双链RNA通过乳糖(6公斤/300升)或本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抑制黑色素形成的ｓｉＲＮＡｓ，其特征在于从具有ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ１核苷酸序列转录获得的ｄｓＲＮＡ经酶切获得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王维荣，刘莉，闵太善，黄伟达，蒲科，黄勇前，谢承光，杨长锁，
申请(专利权)人：上海复旦新杨生物科技有限责任公司，上海复远生物化学研究所有限公司，复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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