大规模生产狂犬病疫苗的方法技术

本发明专利技术涉及一种大规模生产狂犬病疫苗的方法，其工艺步骤为：（１）在以Ｆｉｂｒａ－Ｃｅｌ　　ｄｉｓｋｓ为载体的具有固定床篮式搅拌系统的生物反应器中，用细胞增殖培养液培养Ｖｅｒｏ细胞；（２）在Ｖｅｒｏ细胞生长至一定密度时，换用细胞维持培养液，接种狂犬病毒并使之感染细胞；（３）使病毒增殖；（４）连续收获病毒；（５）超滤浓缩并用β－丙内酯灭活；（６）用硫酸鱼精蛋白或ＤＮＡ酶处理以去除Ｖｅｒｏ细胞ＤＮＡ；（７）以Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　　４　　Ｆａｓｔ　　Ｆｌｏｗ为填料进行层析纯化；（８）加入人血白蛋白、蔗糖为保护剂制成液体制剂，或加入人血白蛋白、蔗糖、明胶作为保护剂和赋型剂制成冻干制剂。采用本发明专利技术的方法可实现在较小容量的生物反应器中，连续收获病毒，实现大规模生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物制药
，具体来说是涉及一种。
技术介绍
狂犬病是一种通过狗、猫、猪、老鼠、和蝙蝠等动物传染的自然疫源性传染病，人一旦被携带狂犬病毒的此类动物咬伤，就会感染发病，其病死率为100％。据不完全统计亚洲狂犬病例每年近3万人左右，我国为狂犬病高发区，80年代每年死亡在5000人以上，进入90年代略有下降，但近年来我国狂犬病发病率有上升趋势。狂犬病没有特殊有效的治疗手段，注射狂犬病疫苗是控制狂犬病流行的唯一有效手段。从1885年路易·巴斯德证明感染了狂犬病毒固定毒的兔脊髓对暴露后免疫具有显著作用开始，人用狂犬病疫苗的发展史已经历了一百二十年。以培养方式区分，人用狂犬病疫苗可以分成组织培养疫苗和细胞培养疫苗两大类。细胞培养疫苗又可分成人二倍体细胞疫苗(HDCV)、原代细胞培养疫苗以及传代细胞系疫苗三大类。Vero细胞即维尔博狂犬疫苗，为传代细胞系疫苗的中的一种，它是一种高纯度狂犬疫苗，是目前世界上较为常用的人用狂犬病疫苗。生产狂犬病疫苗的关键在于培养出足够量的高滴度狂犬病毒。大规模细胞培养是疫苗制品生产工艺中的重要技术环节。在过去十多年来，该技术经历了二代发展，即从第一代使用roller bottle、CellCube等贴壁细胞培养，发展为第二代生物反应器(Bioreactor)进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术的核心问题是难以规模化生产一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。目前，国外一些疫苗制造公司正在发展第二代大规模动物细胞培养技术，它是疫苗制品工业化生产的方向。国际上动物细胞高密度培养技术的应用多采用Cytodex 1悬浮载体，细胞密度可达到107个/毫升。但是由于在生物反应器中装量较少(3～5克/升)，只能做批次培养，而且产业化规模需要较大体积的生物反应器，一般需达到1000升，装备及配套设施成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种在较小容量的生物反应器中实现连续收获病毒的。为实现本专利技术的专利技术目的所采取的技术方案为一种，其特征在于其工艺步骤为(1)在以Fibra-Cel disks(聚酯片)为载体的具有固定床篮式搅拌系统的生物反应器中，用细胞增殖培养液培养Vero细胞；(2)在Vero细胞生长至一定密度时，换用细胞维持培养液，接种狂犬病毒(CTN-1株、aGV株)，并使之感染细胞；(3)使病毒增殖；(4)连续收获病毒；(5)超滤浓缩并用β-丙内酯灭活；(6)用硫酸鱼精蛋白或DNA酶处理以去除Vero细胞DNA；(7)以Sepharose 4 Fast Flow(中文名琼脂糖凝胶4FF)为填料进行层析纯化；(8)加入人血白蛋白、蔗糖为保护剂制成液体制剂，或加入人血白蛋白、蔗糖、明胶作为保护剂和赋型剂制成冻干制剂。Vero细胞是日本学者1962年从非洲绿猴肾建立的猴肾细胞系(即非洲绿猴肾细胞)，其第93代被带到美国国立卫生研究院(NIH)的过敏与传染病研究所热带病毒研究室，第113代被提交给美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号为ATCC NO.CCL-81。经过全面的研究鉴定，Vero细胞具有核学稳定，没有外源因子污染和在一定代次内无致瘤性的优点，完全符合世界卫生组织(WHO)关于用于生物制品的传代细胞的规程要求，并已被WHO批准可用作疫苗生产的基质。本专利技术使用的Vero细胞种来源于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，并可追溯至ATCC，首先建立Vero细胞主种子库和工作种子库，并对其进行系统的检定。在制备疫苗之前，需先进行细胞的复苏、转瓶扩增培养，再以2～5×105/ml的密度接种至生物反应器中，用细胞增殖培养液进行扩增培养，所用的细胞增殖培养液使用199培养基加2～10％牛血清配制而成，为防止细菌污染，在配制细胞增殖培养液的同时可加入适量的硫酸庆大霉素。细胞增殖培养的条件为pH值6.9～7.4(较佳的为7.2)，温度36～38℃(较佳的为37℃)，溶解氧(DO)30～70％(较佳的为50％)，搅拌速度30～150rpm(较佳的为120rpm)。在本专利技术的方法中，所用的Celligen Plus、BioFlo 4500和BioFlo Pro生物反应器购自New Brunswick Scientific Co.，Inc.公司，Celligen Plus涵盖的罐体积为2.2升、5升、7.5升、14升，BioFlo4500涵盖的罐体积为20升、30升，BioFlo Pro涵盖的罐体积为75升、150升、300升，均可进行温度、pH值、溶解氧、搅拌速度的自动控制。Vero细胞为贴壁依赖性细胞，在生物反应器中培养需附着在一定的载体上生长，本专利技术所用的载体为Fibra-Cel disks(聚酯片)，使用量为每升罐体积30～40克。Vero细胞在生物反应器中扩增培养6～12天后可接种狂犬病毒，本专利技术使用的狂犬病毒为CTN-1株和aGV株，CTN-1株来源于中国药品生物制品检定所，aGV株来源于武汉生物制品研究所。接种狂犬病毒前用pH7.6 PBS溶液或199培养基洗涤以洗去残留的牛血清，然后换上细胞维持培养液，所用的细胞维持培养液使用199培养基加0.05％～0.5％人血白蛋白配制而成，狂犬病毒接种量为0.025～0.125MOI感染复数(MOI用于感染的病毒数目与细胞数目的比值)或终浓度4.5～5.5lgLD50/ml(LD50半数致死剂量)。细胞维持培养的条件为pH值7.2～8.0(较佳的为7.6)，温度32～36℃较佳的为35℃)，溶解氧(DO)30～70％(较佳的为50％)，搅拌速度30～150rpm(较佳的为120rpm)。狂犬病毒在Vero细胞上的生长繁殖可维持较长时间，使用生物反应器可连续灌注收获，可连续收获20天以上，病毒滴度保持在7lg LD50/ml以上。收获的病毒液用100K～300K分子量截留的超滤膜浓缩30～100倍，然后用1∶4000 β-丙内酯灭活。以传代细胞制备生物制品安全性的关键是细胞残留DNA的含量，按WHO规程要求，疫苗的基质DNA必须小于100pg/剂。本专利技术去除Vero细胞DNA的方法之一是利用硫酸鱼精蛋白和DNA所带电荷相反，相互结合形成沉淀，通过高速离心去除。具体作法是边搅拌边向灭活病毒浓缩液中硫酸鱼精蛋白至终浓度1～2mg/ml，于2～8℃作用2～4小时，然后于2～8℃ 7000～8000rpm，离心15分钟。另一种方法是用DNase(DNA酶)对浓缩液中的Vero细胞DNA进行切割，具体操作中在经灭活的病毒浓缩液中加入终浓度0.5～1.5U/ml的DNase I，室温下作用6～10小时。用上述两种方法之一去除Vero细胞DNA后以Sepharose 4 FastFlow(中文名琼脂糖凝胶4FF)为填料进行层析纯化，检测结果表明，经上述处理的纯化后病毒原液总蛋白含量减少约99％以上，牛血清和Vero细胞DNA残余量均符合WHO有关规程要求。纯化后病毒原液加入人血白蛋白、蔗糖为保护剂制成液体制剂，或加入人血白蛋白、蔗糖、明胶作为保护剂和赋型剂制成冻干制剂。上述Fibra-Cel disks载体是由英国BIBBY STERIL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大规模生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于其工艺步骤为：（１）在以Ｆｉｂｒａ－Ｃｅｌｄｉｓｋｓ为载体的具有固定床篮式搅拌系统的生物反应器中，用细胞增殖培养液培养Ｖｅｒｏ细胞；（２）在Ｖｅｒｏ细胞生长至一定密度时，换用细胞 维持培养液，接种狂犬病毒，并使之感染细胞；（３）使病毒增殖；（４）连续收获病毒；（５）超滤浓缩并用β－丙内酯灭活；（６）用硫酸鱼精蛋白或ＤＮＡ酶处理以去除Ｖｅｒｏ细胞ＤＮＡ；　（７）以Ｓｅｐｈａｒｏｓ ｅ４ＦａｓｔＦｌｏｗ为填料进行层析纯化；（８）加入人血白蛋白、蔗糖为保护剂制成液体制剂，或加入人血白蛋白、蔗糖、明胶作为保护剂和赋型剂制成冻干制剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建青，何春辉，吴雪红，
申请(专利权)人：广州市嘉合生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]