从人B细胞产生的具有甲型流感病毒中和活性的结合分子制造技术

本发明专利技术涉及产生于人B细胞的具有甲型流感病毒中和活性的结合分子，根据本发明专利技术的具有甲型流感病毒中和活性的结合分子是这样的结合分子，其产生自从感染甲型流感病毒之患者的血液中选择的B细胞，并且具有针对甲型流感病毒的中和活性，因而可用于预防和治疗来源于甲型流感病毒的疾病，并且可用于通过使用根据本发明专利技术的结合分子来诊断流感病毒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从人B细胞产生的具有甲型流感病毒中和活性的结合分子
本专利技术涉及具有针对甲型流感病毒之中和活性的人单克隆抗体，其来源于人B细胞，所述人B细胞选择自从甲型流感病毒的感染中恢复的患者的血液。
技术介绍
流感是由流感病毒的呼吸系统感染引起的疾病，常发生在冬季。已知流感具有很高的感染性，并且影响所有年龄组，特别是老年人(TreanorJ，2004，NEnglJMed.350(3)：218-20)。流感病毒是包膜的RNA(核糖核酸)病毒，属于正粘病毒(Orthomyxoviridae)科，具有由八个反义单链RNA(核糖核酸)区段构成的基因组。这些流感病毒被划分为甲型、乙型和丙型。根据其主要表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，甲型流感病毒被进一步划分为亚型。到目前为止，已经鉴别了16种HA和9种NA(CheungTK和PoonLL2007，AnnNYAcadSci1102：1-25)。流感病毒可根据其类型影响鸟、猪和人，并且具有由RNA区段构成的基因组，因为这个原因，其基因可连续地突变和重组，产生新的遗传改变(TreanorJ，2004.NEnglJMed.350(3)：218-20)。由于这种连续的突变，难以获得针对流感病毒的永久免疫力，因此目前被认为最有效的预防方法是这样的方法，每年施用针对预计将流行之特定类型的流感病毒的疫苗以每年产生针对流感病毒的免疫力。针对流感病毒的疫苗通常使用卵产生，但该生产方法是耗时且低效的方法。因此，该方法的问题在于难以每年在有限的时间框架内生产足够量的疫苗。为了解决这一问题，几家药物公司(GSK、Baxter等)已经积极地进行了通过细胞培养产生疫苗的方法的研究。此外，如果发生流感病毒感染大流行，则在短时间内开发针对感染的疫苗是非常困难的。而且，由于与耐药性突变病毒出现相关的问题，抗病毒药物并非完全可靠的。为了克服这个问题，最近已积极地开发了针对流感病毒的抗体(Throsby等，2008，PloSOne3(e3942)；Sui等，2009，Naturestructural&molecularbiology16(265-273)；Simmons等，2007，PloSMedicine4(e178)；Wrammert等，2011，JExpMed.208(181-193)；Corti等，2011，Science333(850-856))。来自恢复患者的血液产物已经被用于治疗感染多种病毒的患者，以及用于治疗流感感染大流行。例如，当感染西班牙流感病毒的患者具有肺炎症状时，收集自从流感病毒感染恢复之患者的血液产物被用于治疗流感病毒(Luke等，2006.Annalsofinternalmedicine.145：599)。因此，从人血浆中纯化超免疫球蛋白(IgIv)并用于治疗感染多种病毒的患者，但如上所述获得的产物由于血液中潜在的感染原而可能是不安全的，并且对于大量生产是低效的。人B细胞被用于筛选特定人单克隆抗体。然而，通过EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)永生化人B细胞的效率较低且耗时。为了克服这一缺点，已经开发并使用了新技术。这些技术之一是利用RT-PCR法直接从B细胞获得抗体的遗传信息。例如，有一种方法包括：对表达针对特定抗原之抗体的B细胞进行染色，使用FACS分选仪分离B细胞，通过RT-PCR方法从单个B细胞获得抗体的遗传信息，将所述遗传信息插入到表达载体中，并将所述表达载体转染到动物细胞中以产生大量抗体。为了以更简便且更快速的方式进行该生产方法，可以使用以下技术。新技术“芯片上的免疫斑点阵列测定”(immunospotarrayassayonachip，ISAAC)能够在几周内通过筛选单个B细胞(分泌特定单克隆抗体)获得抗体基因(Jin等.，2009NatMed.15，1088-1092)。这样获得的抗体是天然人抗体，其在免疫原性问题方面可以更有效。公开内容技术问题本专利技术的一个目的是提供具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子。本专利技术的另一个目的是提供编码所述结合分子的分离的核酸分子。本专利技术的另一个目的是提供具有插入其中的所述分离的核酸分子的表达载体。本专利技术的另一个目的是提供用表达载体转染的产生结合分子的细胞系。本专利技术的另一个目的是提供用于筛选结合分子的方法。本专利技术的另一个目的是提供包含所述结合分子的组合物。本专利技术的另一个目的是提供使用所述结合分子治疗由甲型流感病毒引起的疾病的方法。本专利技术的另一个目的是提供使用所述结合分子预防由甲型流感病毒引起的疾病的方法。本专利技术的另一个目的是提供使用所述结合分子诊断甲型流感病毒感染的方法。本专利技术的另一个目的是提供用于诊断甲型流感病毒的试剂盒，其包含所述结合分子。技术方案为了实现以上目的，本专利技术提供了具有针对甲型流感病毒的中和活性的结合分子。本专利技术还提供了编码所述结合分子的分离的核酸分子。本专利技术还提供了具有插入其中的所述分离的核酸分子的表达载体。本专利技术还提供了用所述表达载体转染的产生结合分子的细胞系。本专利技术还提供了用于筛选结合分子的方法。本专利技术还提供了包含所述结合分子的组合物。本专利技术还提供了用于预防和治疗由甲型流感病毒引起的疾病的组合物，其包含所述结合分子。本专利技术还提供了用于诊断甲型流感病毒的组合物，其包含所述结合分子。本专利技术还提供了使用所述结合分子治疗由甲型流感病毒引起的疾病的方法。本专利技术还提供了使用所述结合分子预防由甲型流感病毒引起的疾病的方法。本专利技术还提供了使用所述结合分子诊断甲型流感病毒感染的方法。本专利技术还提供了用于诊断甲型流感病毒的试剂盒，其包含所述结合分子。有益效果本专利技术的结合分子具有对甲型流感病毒的结合亲和力和针对其的中和活性，因而可用于预防和治疗由甲型流感病毒引起的疾病，并且也可用于诊断甲型流感病毒感染。附图说明图1是一组图，其示出为了确认初步筛选的结合分子对H3血凝素(下文称作“HA”)的结合亲和力而进行的ELISA的结果。图2示出载体pCT145(A)和pCT147(B)的图谱。A：pCT145载体；B：pCT147载体；pac：编码嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(PAC)的基因；以及DS：二重对称(dyadsymmetry)序列(EBNA1结合oriP中的二重对称(DS)元件)图3是表达本专利技术之结合分子的表达载体的图谱。图4示出使用本专利技术的结合分子进行的动物(小鼠)实验结果。图5示出在使用本专利技术的结合分子进行动物(雪貂)实验期间，测量感染H3N2(A/香港/68)流感病毒后鼻洗液和肺组织中病毒滴度改变的结果。图6示出在使用本专利技术的结合分子进行动物(雪貂)实验期间，测量感染H5N1(A/越南/1203/04)流感病毒后鼻洗液和肺组织中病毒滴度改变的结果。最佳方式下文中，将如下定义本文所使用的术语。本文所用的术语“甲型流感病毒”指属于正粘病毒科并且具有由八个反义单链RNA(核糖核酸)区段构成的基因组的包膜病毒。这些流感病毒被划分为甲型、乙型和丙型，并且根据其主要表面蛋白HA(血凝素)和NA(神经氨酸酶)，甲型流感病毒被进一步划分为亚型。到目前为止，已经报道了16种HA和9种NA。本文所用的表达“H3亚型病毒”指具有H3亚型HA的病毒，并且因而旨在包括H3N1、H3N2、H3N3、H3N4、H本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.09.30 KR 10-2011-00996461.具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子，其中所述结合分子由以下轻链和重链构成，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQIDNO：7所示CDR1区，SEQIDNO：8所示CDR2区和SEQIDNO：9所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定的SEQIDNO：10所示CDR1区，SEQIDNO：11所示CDR2区和SEQIDNO：12所示CDR3区。2.权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子由轻链和重链构成，所述轻链包含SEQIDNO：39所示多肽序列，所述重链包含SEQIDNO：40所示多肽序列。3.权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子具有针对选自以下任一种的中和活性：甲型流感病毒H1、H3、H5、H7和H9亚型。4.具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子，其中所述结合分子由以下轻链和重链构成，所述轻链包含由根据Kabat方法确定的SEQIDNO：24所示CDR1区编码的多肽序列，由SEQIDNO：25所示CDR2区编码的多肽序列和由SEQIDNO：26所示CDR3区编码的多肽序列；所述重链包含由根据Kabat方法确定的SEQIDNO：27所示CDR1区编码的多肽序列，由SEQIDNO：28所示CDR2区编码的多肽序列和由SEQIDNO：29所示CDR3区编码的多肽序列。5.权利要求4所述的分子，其中所述结合分子由轻链和重链构成，所述轻链包含由SEQIDNO：47所示多核苷酸序列编码的多肽序列，所述重链包含由SEQIDNO：48所示多核苷酸序列编码的多肽序列。6.权利要求4所述的结合分子，其中所述结合分子具有针对选自以下任一种的中和活性：甲型流感病毒H1、H3、H5、H7和H9亚型。7.权利要求1或4所述的结合分子，其中所述结合分子是抗体或抗体片段。8.权利要求7所述的结合分子，其中所述抗体或抗体片段是Fab片段、Fv片段、双抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。9.分离的核酸分子，其编码根据权利要求1或4所述的具有针对甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宸在，权起圣，李癸淑，李炫周，全在原，全晃槿，张珉硕，
申请(专利权)人：赛特瑞恩股份有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR