本发明专利技术涉及用于从自人血浆中部分纯化的IgG溶液中获得IgG组合物的新方法，其中通过采用中间热处理并且不使用试剂来沉淀高分子量聚集体/聚合物和/或蛋白质，实现了在该方法过程中产生的IgG聚合物的几乎完全消除。此外，与现有技术的方法相比，该方法提供了高生产率、较低的生产成本并且易于实施。除此之外，通过使用该方法赋予了最终产物在液体中的稳定性。
【技术实现步骤摘要】
通过热处理获得IgG组合物的方法
本专利技术涉及从自人血浆中部分纯化的IgG溶液中获得IgG组合物的新方法，其中通过采用中间热处理步骤并且不使用试剂以沉淀高分子量聚集体/聚合物和/或蛋白质，实现了在该方法过程中产生的IgG聚合物的几乎完全消除。除此之外，与现有技术的方法相比，该方法提供了高生产率、较低的生产成本并且更易于实施。通过使用该方法还赋予了最终产物在液体中的稳定性。
技术介绍
免疫球蛋白G(IgG)是人血清中最丰富的免疫球蛋白的亚类(8-16mg/ml)，其构成所有免疫球蛋白的约80％。IgG适用于治疗多种疾病，例如原发性免疫缺陷(特别是先天性丙种球蛋白缺乏症和低丙种球蛋白血症)、特发性血小板减少性紫癜，作为治疗川崎病(Kawasaki’sdisease)和移植骨髓的佐剂，与慢性淋巴细胞白血病相关的低丙种球蛋白血症，作为儿科患者HIV感染治疗的一部分，等等。目前对免疫球蛋白G(IgG)的要求很高——与广谱人抗体一样是多价的并且具有总体功能性(中和能力、促进调理、平均保存寿命)，具有完整分子(可结晶Fc片段的完整性)和与天然血浆相同或相当的IgG亚类的正常分布，尤其是对于少数亚类(IgG3和IgG4)。用于治疗性施用IgG的途径可以是静脉内、皮下和肌内，并且除此之外，其还可通过其他较不常规的途径施用，例如口服、吸入或表面(topical)途径。虽然如此，无论是用于治疗原发性免疫缺陷还是用于常见变异性免疫缺陷(IgG和IgA亚类不足)(Espanol，T.″Primaryimmunodeficiencies″.PharmaceuticalPolicyandLaw2009；11(4)：277-283)、继发性或获得性免疫缺陷(例如感染病毒(如巨细胞病毒)、带状疱疹、人类免疫缺陷)和自身免疫来源的疾病(例如血小板减少性紫癜、川崎病)(Koski，C.″Immunoglobulinuseinmanagementofinflammatoryneuropathy″.PharmaceuticalPolicyandLaw2009；11(4)：307-315)，静脉内施用都提供了最有用的治疗指征。理想地，供静脉内使用的IgG(IGIV)应以高浓度配制到液体中，并且优选应该能够在高至约30℃下储存，从而有助于产物保存和直接输注。已描述了为了减少可能的IgG不耐受反应，有必要应当使免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM)以及血型凝集素不存在，或者是以检测不到的量存在。还必不可少的是，产品应基本上不含任何酶活性，这两者都通过纤溶酶或纤溶酶原、或者激肽释放酶原、或其活化物、激肽或激肽原、或凝血因子(如因子XI/因子XIa)等的存在来实现。另一方面，用于得到多价IgG的人源初始血浆使得必须将通过病毒或病原体传播的感染的风险减至最小。如Fernandes等(ES500121)和Hirao，Y.等(EP196761和EP253313)所述，在抵抗IgG变性的保护剂(例如，蔗糖、山梨醇、氨基酸)存在下可有效地进行溶液(液体)中IgG的热处理或巴氏灭菌。为此目的，将溶液升温至约60℃的温度维持至少约10小时，使最危险的病原体灭活或减弱。这些病原体可具有脂质包膜，例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)；或者是裸露的，例如骨髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒(HAV)和细小病毒等(UemuraY.等.″Inactivationandeliminationofvirusesduringthefractionationofanintravenousimmunoglobulinpreparation″.VoxSang.1989；56：155-161)。虽然如此，但是即使在稳定剂存在并且在最佳工艺条件下，巴氏灭菌也必然导致形成不可逆的高分子量蛋白质聚集体，例如IgG聚合物和/或其他伴随蛋白质的聚合物，这或多或少地取决于初始IgG的纯度(Hirao，Y.等，见上和Ristol，P.等.EP1225180和ES2091161)。在1960至1970年的十年中，不可逆的高分子量聚集体(称为IgG聚合物)的存在与静脉内施用IgG期间用于活化所述聚集体的补体的消耗(抗补体活性，ACA)有关，并且该现象与所观察到的严重不耐受性或过敏反应有关(Barandum，S.等.VoxSang.7：157-174，1962)。因为这个原因，卫生当局将IGIV中聚合物或高于二聚体之分子形式的最大含量限度规定为3％(欧洲药典专论6.3和CMPCoreSPCfornormalimmunoglobulinforintravenousadministration：CPMP/BPWG/859/95rev.2)。这种考虑对于液体制剂尤其重要，因为3％的限度还必须维持到产品的到期日。因此，在巴氏灭菌之后和在获得最终产物中都必须实现这些IgG聚合物的几乎完全不存在，从而确保产品在长期内不变质并且确保最高的可能储存温度。目前，市场上可得的并且与氨基酸一起配制的大多数液体IgG必须维持酸性pH以避免聚集(Uemura，Y.″DissociationofaggregatedIgGanddenaturationofmonomericIgGbyacidtreatment″.TohokuJ.Exp.Med.，1983；141：337-349)，优选pH4.0至5.0(Tenold，R.等US-4396608)；并且如果它们用0.2M或0.25M甘氨酸(例如已知商标名称为(GrifolsSA，Spain)、或液体的那些(两种都来自于Baxter，UnitedStates))稳定则必须稳定在2至8℃的温度下，或者如果用0.25M脯氨酸(例如(CSLBehring，Germany))稳定则高至25℃，以使储存期间分子聚集最小(Jolles，S.等″Clinicalusesofintravenousimmunoglobulin″.Clin.Exp.Immunol.2005October；142(1)：1-11；Hooper，J.A.″Intravenousimmunoglobulins：evolutionofcommercialIVIGpreparations″.ImmunolAllergyClin.NorthAm.2008；28(4)：765-778)。已证实，经长期暴露于过度酸性pH有助于IgG断裂，例如在4.5或以下的pH和相对高的温度下(例如30℃)(Vermeer，A.等″Thermalstabilityofimmunoglobulin：Unfoldingandaggregationofamulti-domainprotein″.Biophys.J.2000；78：394-404；Shukla，A.等″StrategiestoaddressaggregationduringproteinAchromatography″.BioprocessInternational，May2005)。因此，例如，有文献报道称，虽然在pH4.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于从自人血浆中部分纯化的IgG溶液中获得IgG组合物的方法，包括以下步骤：a)渗滤所述部分纯化的IgG溶液；b)稳定步骤a)中得到的溶液；c)将步骤b)中得到的溶液热处理；d)通过阳离子色谱从步骤c)中经热处理的溶液中选择性吸附高分子量聚集体和/或聚合物；以及e)渗滤并配制步骤d)中得到的溶液。
【技术特征摘要】
2012.03.20 ES 2012304131.一种用于从自人血浆中部分纯化的IgG溶液中获得IgG组合物的方法，所述IgG溶液的IgG含量大于总蛋白质的95％，所述方法包括以下步骤：
a)渗滤所述部分纯化的IgG溶液；
b)稳定步骤a)中得到的溶液；
c)将步骤b)中得到的溶液热处理，其特征在于，所述热处理在55℃至63℃的温度下进行，时间为1至24小时；
d)将氯化钠添加到步骤c)中经热处理的溶液中直至最终浓度为0.2至0.5M；
e)在所述氯化钠添加之后，将所述溶液的pH调节至4.2至5.5；
f)通过阳离子色谱从步骤e)中经热处理的溶液中选择性吸附高分子量聚集体和/或聚合物，所述阳离子色谱使用孔径为20至100μm的不溶性合成灌注基质；以及
g)渗滤并配制步骤f)中得到的溶液。
2.权利要求1的方法，其特征在于，以IgG含量大于总蛋白质的97％的自人血浆中纯化的IgG溶液开始进行所述方法。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于，进行所述渗滤步骤(a)直至乙醇浓度小于0.1％重量/体积。
4.权利要求1或2的方法，其特征在于，进行所述渗滤步骤(a)直至非变性沉淀剂的浓度小于2％重量/体积，并且无论如何在步骤e)后都不产生多于3％的聚合物。
5.权利要求4的方法，其中所述非变性沉淀剂选自PEG、辛酸、相容性非离子型去污剂或其任意混合物。
6.权利要求1或2的方法，其特征在于，进行所述渗滤步骤(a)直至所述初始IgG溶液的离子强度小于1mS/cm。
7.权利要求1或2的方法，其特征在于，步骤(a)结束时的pH值在4.2至6.0的范围内。
8.权利要求1或2的方法，其特征在于，用注射用水或低离子强度的缓冲溶液进行所述渗滤步骤(a)。
9.权利要求8的方法，其特征在于，所述低离子强度的缓冲溶液是乙酸或乙酸钠的≤5mM溶液，所述溶液pH为4.0至5.0。
10.权利要求1或2的方法，其特征在于，以切向流模式通过截留分子量为10kDa至100kDa的膜进行所述渗滤步骤(a)。
11.权利要求1或2的方法，其特征在于，在所述渗滤步骤(a)中，所述蛋白质被浓缩至浓度不超过约5％重量/体积。
12.权利要求1或2的方法，其特征在于，在所述渗滤步骤(a)中，所述蛋白质被浓缩至2％至4％重量/体积的浓度。
13.权利要求1或2的方法，其特征在于，在所述稳定步骤(b)中使用山梨醇作为稳...
【专利技术属性】
技术研发人员：佩雷·里斯托尔德巴尔特，萨尔瓦多尔·格兰沙加蒙，
申请(专利权)人：基立福有限公司，
类型：发明
国别省市：
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