本发明专利技术涉及从生物反应器中生产的蛋白质混合物中纯化抗体的方法，该方法至少包含中间纯化步骤和精提纯步骤，其中所述中间步骤和精提纯步骤包括流经模式的以任一顺序联机的阴离子交换色谱(AEX)步骤和阳离子交换色谱(CEX)步骤。本发明专利技术还涉及单一操作单元，其包括以任意顺序的阴离子交换色谱部分和阳离子交换色谱部分二者，这两个部分串联连接，其中所述单元包括在所述第一离子交换色谱部分的上游端的入口和在所述第二离子交换色谱部分的下游端的出口，并且其中所述单元还包括位于所述第一离子交换色谱部分和所述第二离子交换色谱部分之间的入口。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单一单元离子交换色谱抗体纯化本专利技术涉及单一单元纯化抗体的方法以及可以用在该方法中的装置。用于医药应用的由细胞培养物生产的单克隆抗体的纯化是包含大量步骤的过程。这种抗体必然要摆脱所有潜在有害的污染物，诸如源自生产这些抗体的细胞的蛋白质和DNA、培养基组分诸如胰岛素、PEG醚类和消泡剂以及任何可能存在的感染试剂如病毒和朊病毒。从生产这些蛋白质的细胞的培养物中纯化抗体的典型过程在BioPharmInternational Junl,2005, “Downstream Processing of Monoclonal Antibodies:fromHigh Dilution to High Purity” 中有所描述。因为抗体由诸如为杂交瘤细胞或转化宿主细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠骨髓瘤衍生的NSO细胞、幼年仓鼠肾细胞、人类视网膜衍生的PliR.(:’6K:细胞)的细胞产生，所以必须从细胞培养液中优选在纯化过程初期去除颗粒状细胞材料。该过程的这个部分在本文中被称为“澄清”。随后或者作为澄清步骤的一部分，抗体被粗略纯化至至少约80%，通常是通过“结合加洗脱”色谱步骤(在IgG的情况下通常使用固定的蛋白质A)。这个在本文中被称为“捕集”的步骤不仅导致抗体的初期大幅纯化，还可以导致体积大幅下降，因而产物浓缩。用于捕集的其他替代方法例如为膨胀床吸附(EBA)、2_相液体分离(利用例如聚乙二醇)或采用易溶盐(lyotropic salt,诸如硫酸铵)的分级沉淀。澄清和捕集之后，对抗体进行进一步纯化。通常，为了充分去除残余杂质，在捕集之后需要至少2个色谱步骤。捕集 之后的色谱步骤通常被称为中间纯化步骤，而最终的色谱步骤通常被称为精提纯(polishing)步骤。这些步骤中的每一个通常以间歇模式作为单一单元操作进行，并且这些步骤中的至少一个以“结合加洗脱”模式进行。此外，每一个色谱步骤都需要特定的负载条件，例如pH、电导率等等。因此，为了将负载调节至所需要的条件，在每个色谱步骤之前必须进行额外的处理。上述所有这些使得该过程耗时耗力。在这些步骤中通常被基本去除的杂质都是过程衍生污染物，诸如宿主细胞蛋白质、宿主细胞核酸、培养基组分(如果存在)、蛋白质A(如果存在)、内毒素(如果存在)和微生物(如果存在)。目前的专利出版物中已经描述了许多这样纯化抗体的方法。WO 2010/062244.该专利技术涉及用于分离和纯化蛋白(如单克隆抗体)的双水相萃取加强的沉淀方法。对于随后的进一步纯化抗体，描述了两种备选方案:(I)以结合和洗脱的方式的阳离子交换色谱，然后以流经模式的阴离子交换，或(2)首先是以流经模式的多模式色谱，然后是以流经模式的阴离子交换色谱。WO 2010/048183.该专利技术涉及通过在酸性pH下连续的离子交换和HIC色谱从抗体中去除HCP。WO 2009/138484.首先从说明书和权利要求书中阅读该专利技术并不明确。它涉及通过在蛋白质A(衍生物)柱上捕集抗体并随后从该柱释放抗体来从混合物中纯化抗体。这种后者含抗体材料能够通过例如连续的阴离子色谱和阳离子色谱来进一步纯化。EP 2027921该专利技术涉及基于聚合物伯胺的膜离子交换色谱的介质，以及其在诸如抗体的纯化中的使用。WO 2005/044856涉及使用羟基磷灰石树脂(任选地结合阴离子交换色谱)从抗体制剂中去除高分子量聚集体。W02008/145351描述了均以流经模式的相继的阴离子交换色谱和阳离子交换色-1'TfeP曰。上述方法的缺点是操作时间长、可变成本高(例如由于在“结合加洗脱”步骤本身所必然需要的大的柱容量，因此需要大量昂贵的树脂)和固定成本高(由于劳动力成本)。根据本专利技术的一个实施方式，通过使用均采用流经模式并且优选地作为单一单元操作的串联、联机的阴离子交换色谱(AEX)和阳离子交换色谱(CEX)，能够实现从细胞培养物产生的抗体中非常有效地去除残留杂质。因此，在AEX色谱步骤后和CEX色谱步骤前，合适的缓冲液的联机混合用于调节对于CEX色谱的关于pH和电导率的适合条件。根据本专利技术的另一个实施方式，通过使用均采用流经模式并且优选地作为单一单元操作的串联、联机的阳离子交换色谱(CEX)和阴离子交换色谱(AEX)，能够实现从细胞培养基产生的抗体中非常有效地去除残留杂质。因此，在CEX色谱步骤后和AEX色谱步骤前，合适的缓冲液的联机混合用于调节对于AEX色谱的关于pH和电导率的适合条件。这种新方法的优点是大大减少了操作时间和劳动，并从而降低运行成本。此外，由于所有的单元以仅要求对杂质而非产物的足够的结合能力的流经模式操作，所以需要的色谱单元较小(因而成本较低)。因此，本专利技术可以被定义为从生物反应器中生产的细胞培养液中纯化抗体的方法，其至少包含中间纯化步骤和精提纯步骤，其中新的纯化步骤包含组合的串联、联机的AEX和CEX色谱。这可以以两种备选方式中的一种进行(I)先是阴离子交换(AEX)色谱，作为流出级分得到分离混合 物，然后是串联联机的阳离子交换(CEX)色谱，作为流出级分得到经纯化的抗体制剂，或(2)先是阳离子交换(CEX)色谱，作为流出级分得到分离混合物，然后是串联联机的阴离子交换(AEX)色谱，作为流出级分得到经纯化的抗体制剂，并且其中由这些可选方式得到的经纯化的抗体制剂至少经过一个进一步纯化步骤。W02008/145351也描述了以任意顺序的均采用流经模式的顺序的阴离子交换色谱和阳离子交换色谱。然而，该公开与本专利技术的区别在于，对于来自第一分离步骤的分离混合物为使其准备好用于第二分离步骤而进行的调节是离线进行的。令人惊奇的是，根据本专利技术，能够非常好地完成两个色谱过程的整合，以使两个离子交换的工艺流程可以相互协调，并且同时针对第二色谱步骤的缓冲条件的调节可以被精确地进行，从而实现聚集体的完全清除。在本专利技术的上下文中，“分离混合物”是指从本专利技术的第一离子交换步骤中得到的溶液，“经纯化的抗体制剂”是指从本专利技术的第二离子交换步骤中得到的溶液。本申请通篇采用这样的术语。在第一离子交换色谱步骤之前，通常对在生物反应器中生产的细胞培养液进行澄清(即除去所有细胞材料，诸如全细胞和细胞碎片)。而且，在第一离子交换色谱步骤之前，为了确保用于该第一离子交换步骤的关于pH和电导率方面的最佳条件，可以将调节溶液添加到细胞培养液中或含抗体溶液中。在具体的实施方式中，本专利技术的方法包括作为单一单元操作运行的组合AEX和CEX 了的色谱。“流出级分”在本文中是指以与洗脱流体基本上相同的速度离开色谱柱的所加载的含抗体级分的至少一部分。该级分在洗脱过程中基本上不在柱上保留。因此，选择条件以使杂质而不是抗体与阴离子交换材料和阳离子交换材料结合。例如在上述WO 2009/138484中已经公开了使用利用阴离子交换和阳离子交换相互作用色谱的蛋白质混合物的顺序色谱分离来分离蛋白质。其中，两个离子交换步骤作为两个单独的步骤来进行。业已发现，为了大规模生产的目的，本专利技术的方法(采用流经模式)与现有的公开方法(采用所需抗体的结合并洗脱)相比提供远远更快的分离。有利的是，含有抗体的分离混合物被补充适量的溶液，以调节pH和电导率，以在本专利技术的第二离子交换色谱步骤中获得最佳性能。令人惊奇地发现，在进入本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：迪德里克·瑞恩德·克里玛，马里杰克·伊万内·多斯特，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：
国别省市：
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