用于检测施马伦贝格病毒的套式RT-PCR引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测施马伦贝格病毒的套式RT-PCR引物组及试剂盒，所述引物组的序列如SEQIDNO.1～4所示，所述试剂盒中含有该引物组及RNA提取试剂、反转录试剂、施马伦贝格病毒阳性对照和阴性对照。本发明专利技术建立的试剂盒具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉等优点，可用于施马伦贝格病毒的快速初筛。

【技术实现步骤摘要】
用于检测施马伦贝格病毒的套式RT-PCR引物组及试剂盒
本专利技术属于分子生物学检测领域，特别涉及一种用于检测施马伦贝格病毒的套式 RT-PCR引物组及试剂盒。
技术介绍
施马伦贝格病（Schmallenberg，SB)是2011年11月在德国北莱茵-威斯特法伦 州施马伦贝格镇牛羊中发现的一种新的病毒性动物传染病，该病的主要临床特征是：受感 染母羊流产、死胎，新生羔羊畸形、成活率下降，感染牛表现为腹泻、发热、产奶量下降等，对 畜牧业造成了较大危害。 目前SB的实验室诊断方法主要包括细胞培养分离病毒等病原检测方法，以及酶 联免疫吸附试验（ELISA)、间接免疫荧光试验（IFA)和中和试验（NT)等血清学方法。病毒分 离通常是确诊疫病的金标准，但由于成年患病动物常不表现临床症状，难以掌握病毒血症 的具体时期，且费时费力，因此病毒分离的实施受到一定的限制，不适应快速检测的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测施马伦贝格病的套式RT-PCR引物组及试剂 盒。 本专利技术的另一个目的在于提供上述RT-PCR引物组及试剂盒在检测施马伦贝格病 上的应用。 本专利技术所采取的技术方案是： 一组用于检测施马伦贝格病的套式RT-PCR引物，其是根据施马伦贝格病毒核衣壳蛋 白基因序列的商度保守区域设计的。其核昔酸序列如下所不： 外引物 Pl :5' - TACATAAGACGGCACAAC C -3'（SEQ ID NO. 1); 外引物 P2 :5' - GCATCAAGGAACATTTCG -3，（SEQ ID NO. 2); 内引物 Pl :5' -TGGGCCGATGGTTATACAATG -3'（SEQ ID NO. 3); 内引物 P2 :5, - TTGGCGGAGGACTTTTTTCA-3'（SEQ ID N0.4)。 -种用于检测施马伦贝格病的套式RT-PCR试剂盒，其含有如上所述的引物组。 上述试剂盒中还含有RNA提取试剂、反转录试剂、施马伦贝格病毒阳性对照和阴 性对照。 所述的RNA提取试剂包括样品裂解液、氯仿、DEPC-乙醇、异丙醇和DEPC-H2O中的 一种或多种；所述的反转录试剂包括反转录缓冲液、MgCl 2、dNTP、RNA酶抑制剂、随机引物、 AMV、反转录酶和DEPC-H2O中的一种或多种；所述的施马伦贝格病毒阳性对照为施马伦贝格 病毒阳性样板的cDNA，所述阴性对照为所述阴性对照为无菌采取澳洲进口牛血清，经检测 BSV、BTV、EHDV、AKV、BVDV、IBRV 为阴性。 以上所述的试剂盒在施马伦贝格病检测中的应用。 本专利技术的有益效果是：本专利技术建立的套式RT-PCR试剂盒具有特异、敏感、重复性 好、快速、费用低廉等优点，可大范围用于施马伦贝格病的快速初筛。 【附图说明】 图 1 为一步式 RT-PCR 电泳结果图（M :DNA Marker DL-2000 ;1 :pMD-SBV 质粒；N : 阴性对照；B :空白对照）； 图2为套式PCR检测结果图（M :DNA Marker DL-2000 ;P :阳性对照；1 :被检样品；N :阴 性对照；B :空白）； 图3为外引物特异性试验电泳图（M :DNA Marker DL-2000 ;P :阳性对照N :阴性对照； I :BTV ;2 :EHDV ;3 :AKV ;4 :BVDV ;5 :IBRV ;6 :SBV ; B :空白对照）； 图4为内引物特异性试验电泳图（M :DNA Marker DL-2000 ;P :阳性对照N :阴性对照； I :BTV ;2 :EHDV ;3 :AKV ;4 :BVDV ;5 :IBRV ;6 :SBV ; B :空白对照）； 图5为外引物敏感性试验电泳图（M :DNA Marker DL-2000 ;P :阳性对照；N :阴性对照； B:空白对照；I =KT1稀释；2 :1(Γ2稀释；3 :1(Γ3稀释；4:1(Γ4稀释；5 :1(Γ5稀释；6 :1(Γ6稀释 7 : KT7 稀释；8 : KT8 稀释；9 : KT9 稀释）； 图6为内引物敏感性试验电泳图（Μ :DNA Marker DL-2000 ;Ρ :阳性对照；N :阴性对照； B :空白对照；I =KT1稀释；2 :1(Γ2稀释；3 :1(Γ3稀释；4 : KT4稀释；5 : KT5稀释；6 : KT6稀释 7 :10_7 稀释；8 :10_8 稀释；9 :10_9 稀释)。 【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。 实施例1引物设计 从Genebank下载多个施马伦贝格病（SBV)的核衣壳蛋白基因序列，用DNASTAR 5. 07软 件进行比对，寻找高度保守的区域，然后选取适当的基因序列，设计特异性检测SBV S基因 的套式RT-PCR引物(见表1 )，送大连宝生物技术有限公司合成，用DEPC处理水溶解，-80°C 避光保存。 表1施马伦贝格病毒套式RT-PCR引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于检测施马伦贝格病毒的套式RT‑PCR引物， 其特征在于，所述引物是根据施马伦贝格病毒核衣壳蛋白基因序列的高度保守区域设计的。

【技术特征摘要】
1. 一组用于检测施马伦贝格病毒的套式RT-PCR引物，其特征在于，所述引物是根据 施马伦贝格病毒核衣壳蛋白基因序列的高度保守区域设计的。2. 根据权利要求1所述的用于检测施马伦贝格病毒的套式RT-PCR引物，其特征在于， 其核苷酸序列如下所示： 外引物 P1 :5' - TACATAAGACGGCACAACC -3'（SEQ ID NO. 1); 外引物 P2 :5, - GCATCAAGGAACATTTCG -3，（SEQ ID NO. 2); 内引物 PI :5' -TGGGCCGATGGTTATACAATG -3'（SEQ ID NO. 3); 内引物 P2:5，_ ITGGCGGAGGACTTmTCA-3'（SEQ ID N0.4)。3. -种用于检测施马伦贝格病毒的套式RT-PCR试剂盒，其含有权利要求1或2所述的 引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨素，黄海超，陈轩，陶旻，徐海聂，许彩芸，沙才华，廖秀云，罗宝正，薄清如，
申请(专利权)人：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：广东;44