一种短颈剑线虫的分子鉴定方法技术

本发明专利技术公开了短颈剑线虫的鉴定方法，包括以下步骤：提取待测线虫的DNA；使用正向引物、反向引物、探针序列进行实时PCR；根据Ct值的不同，判断线虫是否为短颈剑线虫。本发明专利技术方法可快速、准确、稳定的鉴别线虫是否为短颈剑线虫。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检疫方法，特别涉及。
技术介绍
2008年10月-2010年2月，对广东省的园林植物进行寄生线虫病害调查，共采集了 512份样品进行线虫分离。根据形态特征、形态测量值及结合分子数据，共鉴定出潜在传毒线虫4属12个种总计在33份样品中发现美洲剑线虫组(ZZMiz^ffl3 americanum group)内群体，在20份样品中发现标明剑线虫(Ζ i/^i卵￠0群体，在27份样品中发现巴西剑线虫(Ζ brasiliense),分别占检测到传毒类线虫群体总数的31. 9%、19. 1%和 12.8%。其中中国新记录种1个腔室剑线虫(Z da 力ers)；中国大陆新记录种1个 克鲁克剑线虫(Z Ar^"/) ;2种传毒线虫胼胝拟毛刺线虫和短颈剑线虫 (Z brevicollum)；其它重要的病原线虫2种标明剑线虫(Z iasi卵e)、雪松毛刺线 ^kCTrichodorus cedarus)；本研究所鉴定的12个种中，克鲁克剑线虫和荔枝长针线虫 Uongidorus litchii) ^^XCroton iiWi腫)上的新记录；肾形拟毛刺线虫和胼胝拟毛刺线虫是灰木莲glanca)上的新记录；短颈剑线虫O brevicollum) 是灰木莲、红背 {Excoecaria cochinchinensis)> 石 Ilf iPhotinia serrulata、、秋枫(Mischofia javanica )和羊蹄甲QBauhinia bIakearm )上的新记录；巴西剑线虫 (Z brasiliense )是梅叶冬青(//ez asprella )、杜英 iMlaeocarpus syl ves tris )禾口火力楠(Mchelia macclurei )上的新记录；标明剑线虫(Z insigne )是黄葛榕、Ficus Fii-e/75·)、木棉{Bombax malabaricumMM 口十楽积才{Koelreuteria bipinnata )禾口散尾奏 (Chrysalidocarpus Iu tescens )上的新记录。胼胝拟毛刺线虫寄主范围广泛，多达100多种。主要危害的农作物和经济作物包括疲菜(Spinacia oleracea )、古月萝卜(Daucus caro )、大豆(Glycine max )、豆 MXPisum sa ti vum ) > 51 ii (vigna sinensis ) > # ^jp (.Lycopersicon esculentum)、畏官 (.Lactuca sa i>a ) > ΞΕ(Zea mays ) > ^ ipyrus pyrifolia ) > ^^ (Prunus ^ersica )、香舊 iMusa spp.)、葡萄(K/ tis Vinifera )、柑橘(CY trus spp.)、梓檬(CY trus linion )、无花果 QFicus carica)、油橄榄(0/ea)等(Decraemer，1995)。在日本，此线虫还可寄生5 种针叶树和26种阔叶树，其中包括日本厚朴(ife卵o/ia obvataXMamiya, 1967 ；Shishida, 1979)。此树隶属于木兰科(Magnoliaceae)，木兰属Ofe卵o/ia Linn\而灰木莲也属于木兰科，应提高对此虫的重视程度。据报道，此线虫能够严重破坏山茶花的根部，在人工控制条件下还能够危害玉米和高粱(5br功腫nil gar e\ Ayala等(1968)报道了在人工控制条件，胼胝拟毛刺线虫能够在取食被病毒侵染的烟草后传播烟草脆裂病毒的加利福尼亚分离物。Weischer等(2000)也报道了在北美此线虫是烟草脆裂病毒的传毒介体。肾形拟毛刺线虫U3, renifer)是Siddiqi在马铃薯、Solanum tuberosum)根部发现的。它的次异名有..Paratrichodorus (Mnidorus)renifer Siddiqi，1Θ74 禾口 renifer Siddiqi，1974。这种线虫在印度、西澳大利亚州、喀麦隆、美国、英国、加拿大、斯洛伐克共和国、巴基斯坦、中国等地分布，可以寄生马铃薯、葡萄、茶(snensis )、狗牙 {Cynodon dactylon )>￠1 {Rhododendron japonicum)>Μ (Semen Trigonellae)> ^1 ilachca sativa)、姜取 ijiedychium coronariums)(Siddiqi, 1974 ； Jana etal, 1984 ；Cotton et al, 1991 ；Nasira et al, 1994 ；Ye, 1995 ；Kazi et al, 1996 ；谢辉等， 1996 ；Forge et al, 2009)，能够对多种作物造成严重损失，应重视对它的检测防治。雪松毛刺线虫(7cedarus )是 Yookoo (1964 )在日本的柳杉(Cryp tomeria japonica )根部发现的。它的次异名有-.Trichodorus Longistylus, Yokoo，1964 和 Trichodorus kurumeensis, Xokoo, 。这种线虫分布的国家不多，仅在中国、日本、韩国和美国的佛罗里达州报道过。(Yookoo, 1964 ；Mamiya, Y. 1967 ；Baek et al, 1995 ；Xu et al, 1995).该种线虫可以寄生多种植物。在日本，雪松毛刺线虫广泛分布，成为日本森林苗圃中最重要的植物寄生线虫之一。据报道，它可以危害柳杉、日本厚朴、日本落叶松 {Iari χ 1 epto 1印i s)、矫饿We 11 i s sifleasis)等30多种乔木植物。此虫还可以危害大豆、结球甘蓝(^ra1S1Sica oleracea)与大轰(Jtordeum vuIgare )等农作物。在中国，它可以寄生梨、桃、苹果、柿树(历仍/？斤仍kaki、、奄饿QPrunus armeniaca)等果树和福州杉 (Cunninghamia lanceolata ) (Shishida, 1979 ；Lee, 1976 ；Xu et al, 1995)。 Yokoo (1964) 认为雪松毛刺线虫是引起黑松GdZzw1S thunbergii)和雪松ifeoi/ara)短粗根病的病原物。它还可以寄生多种果树，因此对该线虫，生产上需予以高度重视，以便防患于未然。其他各种传毒线虫同样对林业、农业有着不良的影响，同样需要高度重视，以便防患于未然。传统的植物寄生线虫的分类鉴定是以线虫形态学特征，结合形态测量值为主要依据的，对于生理小种或致病型等种下群体的鉴定，则基于对鉴别寄主或寄主植物不同品种的反应型的生物测定法来确定。对于长针科线虫和毛刺科线虫的传统鉴定，主要依据形态学特征结合形态测量值来进行分类。目前，剑线虫属的形态学鉴定主要依据Loof等(1990) 的多歧检索表及其增补(Loof et W，1993，1996)。该多歧检索表根据本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种短颈剑线虫实时荧光ＰＣＲ检测方法，包括以下步骤：（１）取待检样品，提取基因组ＤＮＡ，制备模板ＤＮＡ；（２）建立ＰＣＲ反应体系：取正向引物ＸＢ－Ｆ、反向引物ＸＢ－Ｒ、引物探针ＸＢ－Ｐ、１０×ＰＣＲ缓冲液、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ混合物、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶和ｄｄＨ２Ｏ，加入待检模板ＤＮＡ，配成ＰＣＲ反应体系；其中所述正向引物ＣＣ－Ｆ６、反向引物ＣＣ－Ｒ８和探针ＣＣ－ＴＺ－６的核苷酸序列分别为：正向引物：ＸＢ－Ｆ　　５’－ＣＧＴＡＡＣＣＡＧＣＴＣＧＴＴＣＧＧＴＡＧＡ－３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１），反向引物：　ＸＢ－Ｒ　　５’－ＴＣＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＴＡＴＡＧＡＴＣＣＧ　－３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　２），探针序列：ＸＢ－Ｐ　５’－ＦＡＭ－ＧＡＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣＡＧＧＴＡＣＣＧＡ－ＴＡＭＲＡ－３’ＦＡＭ为荧光报告基团，ＴＡＭＲＡ为荧光淬灭基团；（３）进行ＰＣＲ扩增；（４）荧光ＰＣＲ仪读取Ｃｔ值判断检测的结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张卫东，廖力，迟远丽，徐淼锋，
申请(专利权)人：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：44