本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法及试剂盒。本发明专利技术所述检测方法为在东南亚缺失型α地中海贫血缺失片段断端的两侧设计一对引物Fd5和Rd3及探针Prob-D，在缺失片段5′端设计一条反向引物Rq5及探针Prob-Q，提取待测样品DNA，以待测样品DNA为模板进行实时荧光PCR反应，然后根据实时荧光PCR扩增曲线分析待测样品。本发明专利技术所述试剂盒包括引物Fd5、Rd3和Rq5与标记不同波长报告荧光基团的Prob-D和Prob-Q。本发明专利技术所述检测方法根据荧光信号强度在扩增的同时进行检测，节省了时间，提高了灵敏度，是一种简单、快捷，灵敏度高，易于推广的检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体的说是涉及一种检测东南亚缺失型α地中海贫 血的方法及试剂盒。
技术介绍
地中海贫血又称海洋性贫血，由于最初发现于地中海沿岸的国家，如意大利、希 腊、马尔他等国而得名。它是一组遗传性溶血性贫血病，由于珠蛋白基因的缺失或点突变所 致。组成珠蛋白的肽链有4种，α、β、Υ、δ链，分别由其相应的基因编码，这些基因的 缺失或点突变可造成各种肽链的合成障碍，致使血红蛋白的组分改变。通常将地中海贫血 分为α、β、δ β和δ等4种类型，其中α地中海贫血是最主要的地中海贫血类型之一， 也是全世界最常见的遗传病之一。我国南方为α地中海贫血病的高发区，全国90万人的 流行病学调查得出的总发病率为2. 46%。α地中海贫血是由位于人类16号染色体末端的α -珠蛋白基因缺陷所致，可划分 为缺失型和非缺失型两大类，其中，缺失型发病率远高于非缺失型。α-珠蛋白基因的结构 见图1，图中显示，编码α类珠蛋白基因串联在一起组成α-珠蛋白基因簇，从5'至3'依 次为ξ 2-Ψ ξ 1(假ξ)-Ψ α2-Ψ α 1-α2-α 1-θ 1。其中，ξ产生胎儿血红蛋白的组成成 分ξ珠蛋白链，在胎儿早期表达，后期至出生后，逐渐被α 2，α 1所代替。α 2，α 1是两个 重要的功能基因，虽然二者的序列99. 99%都完全相同，但研究表明，α 2基因的表达要比 α 强。其余四个基因即Ψξ，Ψα2，ψα ，θ 1都是假基因，不表达蛋白，但其序列与α 基因也高度同源。迄今在亚洲地区和国家α地中海贫血患者中已发现多种大片段α基因的缺 失，如，发现于菲律宾人群中的菲律宾型缺失(一Fil)和发生于泰国人群中的泰国型缺失 (-Thai)。而在我国迄今发现三种缺失型右侧缺失型(_α 3. 7)、左侧缺失型(_ α 4. 2)和 东南亚型(一SEA)。- α 3. 7型主要缺失的是α 1基因，缺失片段长3. 7Kb ；-α 4. 2型缺失的 是α 2基因，缺失片段长4. 2Kb;而东南亚型(一SEA)2个功能基因即α2，α 1全部缺失， 缺失片段长达20Kb。一SEA型的携带者(一SEA/α α)的染色体中一条16号染色体上缺失 20Kb α基因簇片段，而另一条正常，会显示一定的贫血症状，病理生理改变轻微，即轻型α 地贫(αΟ-地贫)。而东南亚型(一SEA)的纯合子(一SEA/-SEA)，其4个α珠蛋白基因 均缺失或缺陷，以致完全无α链生成，因而含有α链的HhA、HbA2和HbF的合成均减少，是 α-地贫中最为严重的一种，即重型α地贫。患者在胎儿期即发生大量Y链合成Y 4 (Hb Bart' s), Hb Bart' s对氧的亲合力极高，造成组织缺氧而引起胎儿水肿综合征，胎儿常 于30 40周时流产、死胎或娩出后半小时内死亡。目前对α地中海贫血尚无有效的治疗方法，因此开展遗传筛查和产前诊断选择 性淘汰重症α地贫胎儿是控制该病发生最有效的预防措施。由于基因诊断取材不受组织 器官特异性限制，怀孕早期的绒毛或中期的羊水均可用于检测，因此目前大都利用基因诊 断技术进行遗传筛查和产前诊断。经典的Southern杂交技术能诊断Hb Bart' s水肿胎，但因该法操作繁琐、实验周期长、使用放射性核素标记等诸多限制，而不利于临床推广应用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术目的是针对现有的检测方法的缺陷，提供一种简便、快捷，灵敏 度高的检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案一种检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法，为针对Genebank登录号为 ΑΕ006462的α类珠蛋白基因，在东南亚缺失型α地中海贫血缺失片段断端的两侧设计一 对引物Fd5和Rd3及探针ftx)b-D，在缺失片段5 ‘端设计一条反向引物Rq5及探针ftx)b-Q， 其中，所述引物Fd5为第155115至第155755位之间长度为15bp 30bp的核苷酸序列，Rd3 为与第174721至第175321位核苷酸互补的长度为15bp 30bp的核苷酸序列，Rq5为与 第155395至第155895位核苷酸互补的长度为15bp 30bp的核苷酸序列，所述ftx)b-D为 与第174780至第174900核苷酸互补的长度为15bp 30bp的核苷酸序列，Prob-Q为与第 155533至第155653位核苷酸序列区域互补的长度为15bp 30bp的核苷酸序列，Prob-D 和ftx)b-Q标记不同波长的报告荧光基团；提取待测样品DNA，以待测样品DNA为模板进行实时荧光PCR反应，根据实时荧光 PCR的扩增曲线分析待测样品。本专利技术所述东南亚缺失型α地中海贫血缺失为涵盖α -珠蛋白基因簇的约20Kb 基因片段，即Genebank登录号为AE006462的α类珠蛋白基因的第155569位第174707位 的核苷酸序列。本专利技术所述检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法的原理如图2所示，针对 Genebank登录号为ΑΕ006462的α类珠蛋白基因，在东南亚缺失型α地中海贫血缺失片段 断端的两侧设计一对引物Fd5和Rd3及探针ftx)b-D，在缺失片段5'端设计一条反向引物 Rq5及探针ftx)b-Q。荧光PCR扩增时在加入引物的同时加入特异性的荧光探针。当扩增正 常基因时，由于没有缺失发生，位于断端两侧的引物Fd5和Rd3之间的距离大于20Kb，而一 般PCR扩增无法扩增大于5Kb的片段，故引物Fd5和Rd3无法扩增得到PCR产物，而缺失片 段上的引物Rq5与引物Fd5相邻，能够扩增出一段50bp 500bp的PCR产物，该PCR产物序 列与可ftx)b-Q配对，Prob-Q标记的荧光基团发射荧光，且随着扩增循环数的增加，PCR产物 不断增加，Prob-Q与PCR产物结合后发出的荧光信号不断加强。当扩增有东南亚缺失的α 地中海贫血基因时，由于有缺失发生，位于断端两侧的引物Fd5和Rd3相互靠近，能够扩增 一段长度在50 500bp之间的PCR产物，该PCR产物序列与ftx)b-D配对，Prob-D标记的荧 光基团发射荧光，并且随着扩增循环数的增加，PCR产物不断增加，Prob-D与PCR产物结合 后发出的荧光信号也不断加强。由于ftx)b-D和ftx)b-Q分别标记不同波长报告荧光基团，因 此通过不同波长的通道进行检测可以判断与PCR产物结合的是那种探针，进而判断待测样 品是否为东南亚缺失型，并且可以区分东南亚缺失型α地中海贫血纯合子和杂合子样本。基因组DNA含有细胞中全部的遗传信息，因此，为了完成本专利技术的方法，首先需提 取待测样品DNA，然后以提取的DNA为模板，进行实时荧光PCR反应。目前在医学和生物学 领域提取DNA的成熟方法有很多，本专利技术所述检测方法提取待测样品可以采用目前报道的 任何一种成熟的提取人基因组DNA的方法，包括但不限于裂解沉淀法，煮沸裂解法以及离心柱纯化法。优选的，本专利技术所述提取待测样品DNA的方法为离心柱纯化法。引物是在聚合作用的起始时，与反应物以共价键形式连接的一段短的单链核苷酸 序列，作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3'端开始合成新的核酸链。本发 明所述检测方法包括三条引物分别为Fd5、Rd3和Rq5，其中，所述Fd5本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法，其特征在于，针对Ｇｅｎｅｂａｎｋ登录号为ＡＥ００６４６２的α类珠蛋白基因，在东南亚缺失型α地中海贫血缺失片段断端的两侧设计一对引物Ｆｄ５和Ｒｄ３及探针Ｐｒｏｂ－Ｄ，在缺失片段５′端设计一条反向引物Ｒｑ５及探针Ｐｒｏｂ－Ｑ，其中，所述引物Ｆｄ５为第１５５１１５至第１５５７５５位之间长度为１５ｂｐ～３０ｂｐ的核苷酸序列，Ｒｄ３为与第１７４７２１至第１７５３２１位核苷酸互补的长度为１５ｂｐ～３０ｂｐ的核苷酸序列，Ｒｑ５为与第１５５３９５至第１５５８９５位核苷酸互补的长度为１５ｂｐ～３０ｂｐ的核苷酸序列，所述Ｐｒｏｂ－Ｄ为与第１７４７８０至第１７４９００位核苷酸互补的长度为１５ｂｐ～３０ｂｐ的核苷酸序列，Ｐｒｏｂ－Ｑ为与第１５５５３３至第１５５６５３位核苷酸序列区域互补的长度为１５ｂｐ～３０ｂｐ的核苷酸序列，Ｐｒｏｂ－Ｄ和Ｐｒｏｂ－Ｑ标记不同波长的报告荧光基团；提取待测样品ＤＮＡ，以待测样品ＤＮＡ为模板进行实时荧光ＰＣＲ反应，根据实时荧光ＰＣＲ的扩增曲线分析待测样品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丁亚平，毕少辉，
申请(专利权)人：深圳康美生物科技股份有限公司，北京康美天鸿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：94
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