肺炎支原体荧光定量引物及探针、检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及肺炎支原体荧光定量引物及探针、检测方法及试剂盒。本发明专利技术通过实验证实，以本发明专利技术提供的引物和探针对肺炎支原体进行检测，准确性可达100％，对其他病原体未见非特异性的扩增，特异性良好。通过对不同拷贝的肺炎支原体标准品系时候进行检测，该引物和探针对肺炎支原体能检测出的最低拷贝数为100copies/μL，具有良好的灵敏性。以阳性参考品为模板，重复10次反应，Ct值方差小于2％，对肺炎支原体待检序列具有很高的准确性。本发明专利技术提供的引物和探针对高、低两个浓度的参考品均具有很高的精密性，每批试剂批内变异系数小于5％，连续三批试剂批间变异系数小于5％。

Fluorescence quantitative primers, probes, detection methods and kits of Mycoplasma pneumoniae

The invention relates to the field of biological technology, in particular the fluorescent quantitative primers and probes, detection methods and kits of Mycoplasma pneumoniae. The invention confirms the accuracy and accuracy of the primers and probes for Mycoplasma pneumoniae by the experiment. The accuracy is 100%, and no specific amplification is found for other pathogens. Through the detection of different copies of Mycoplasma pneumoniae standard strain, the primer and probe can detect the lowest copy number of Mycoplasma pneumoniae, which is 100copies/ L, and has good sensitivity. The positive reference was used as a template and repeated 10 reactions. The variance of Ct value was less than 2%. It had high accuracy for the sequence of Mycoplasma pneumoniae. The primers and probes provided by the invention have high precision for reference materials with high concentration and low concentration, and the coefficient of variation within batches of each batch is less than 5%, and the coefficient of variation between three batches of batches is less than 5%.

【技术实现步骤摘要】
肺炎支原体荧光定量引物及探针、检测方法及试剂盒
本专利技术涉及生物
，尤其涉及肺炎支原体荧光定量引物及探针、检测方法及试剂盒。
技术介绍
肺炎支原体(MycopasmaPneumoniae，MP)是介于病毒和细菌之间的一种微生物，含DNA和RNA，没有细胞壁。MP的全基因测序已经完成，P1蛋白的附近，有两个特异性重复序列(RepPM2/3和RepMp4)，可将MP分为两型，一型是以M129为代表的Group1，二型是以FH为代表的Group2。编码P1的P1基因位于M129型的180858-185741nt位，共4884个核苷酸，编码1627个氨基酸，G+C含量为54％，远高于全基因序列的平均值40.1％。P1蛋白前体中的前59位氨基酸是一段前导肽，成熟的P1蛋白由1568个氨基酸组成。肺炎支原体是引起社区获得性肺炎的重要致病原。感染流行周期为4～7年，流行时发病增加3～5倍，可在任何年龄发生，但其下呼吸道感染主要发生在学龄儿童和年轻人，尤其以5～20岁更多见。肺炎支原体通过飞沫以气溶胶微粒的形式传播，传染性较小，需要长时间密切接触才能发病，在家庭成员中易相互传染，其潜伏期16～32d，潜伏期即具传染性，症状出现1周内呼吸道含菌量最高，至症状缓解数周仍具传染性，患者痊愈后可在咽部存留1～5月。支原体肺炎是一种非常严重的传染性疾病，在肺炎中，支原体肺炎约15％～20％，并且导致多种并发症，支原体肺炎是由肺炎支原体引起的急性肺部感染。肺炎支原体广泛存在，无地区性差异，平时散发，支原体肺炎每4～5年又一次流行。发病季节不明显，寒冷季节发病率较高，占住院肺炎的10％～20％，流行期间可占30％。肺炎支原体的感染可发生在不同年龄的小儿，在年长儿多见，在新生儿中报道不多。肺炎支原体的感染率有逐年增多的趋势，临床主要表现为咳嗽、咳痰、哮喘、气促、胸闷、胸痛及不同程度的发热和惊厥等。肺炎支原体感染也可导致一系列呼吸系统外疾病，可引起支原体血症，直接侵犯个系统、组织引起病变。国外报道，从肺炎支原体呼吸道感染的病例血液中直接分离出肺炎支原体，提示肺炎支原体可进入血液，存在呼吸道以外的部位增殖的可能性。支原体感染引起的肺外并发症常累及心血管系统、血液系统、中枢神经系统、皮肤及肝肾器官。由于培养法的困难和血清学方法的滞后，需寻找更灵敏更快速的方法。近十年来，定量PCR检测方法的建立提供了一种快速，可靠的呼吸道病原检测方法。具有快速，灵敏，定量准确等特点。目前，已经有运用多重定量PCR方法同时检测上述病原体的报道，多重定量PCR的应用极大的提高检测的效率，并且节省了样本量。PCR检测MP的靶基因主要有16SrRNA、ATPase、P1cytadhesin、CARDStoxin、RepMP等，其中P1基因是广泛用于试剂盒的靶基因。实时荧光定量PCR技术是近些年来迅速发展起来的一种核酸检测技术。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。因为实时荧光定量PCR技术的检测物为致病病原体基因核酸，所以能够准确检测处于疾病各个时期的病原体。目前实时荧光定量PCR所使用的荧光化学可以分为两种：荧光探针和荧光染料。由于Taqman探针具有特异性强、准确性高、对引物及试剂要求不高等优点，使该类型的荧光探针常用于实时荧光定量PCR。为了实现将实时荧光定量PCR技术应用于肺炎支原体的检测，很有必要提供一种特异性高、准确性高的肺炎支原体核酸检测的引物和探针。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供肺炎支原体荧光定量引物及探针、检测方法及试剂盒，本专利技术提供的引物及探针针对肺炎支原体P1蛋白基因设计，具有良好的灵敏度、特异性、准确性和精密性。肺炎支原体荧光定量检测引物组，包括如SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物和如SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物。本专利技术还提供了肺炎支原体荧光定量检测探针，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术提供的肺炎支原体荧光定量检测探针的3’端标记有MGB淬灭基团；5’端标记有6-FAM发光基团。本专利技术根据肺炎支原体P1蛋白基因的保守序列设计合成对应肺炎支原体荧光定量引物，本专利技术提供的探针和引物用于肺炎支原体的荧光定量检测具有良好的特异性、重复性和灵敏性。其能检测出的最低拷贝数为100copies/μL。对肺炎衣原体、肺炎支原体和结核分枝杆菌均无交叉反应，具有很高的特异性。以阳性参考品为模板，重复10次反应，Ct值方差小于10％，对肺炎支原体待检序列具有很高的准确性。本专利技术提供的引物和探针对高、低两个浓度的参考品均具有很高的精密性，每批试剂批内变异系数小于5％，连续三批试剂批间变异系数小于5％。本专利技术还提供了肺炎支原体检测试剂盒包括：SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物、SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物，和SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针。本专利技术的试剂盒中还包括样品处理液；所述样品处理液中包括以下浓度的组分：本专利技术的试剂盒中还包括PCR反应液A，PCR反应液B；PCR反应液A中包括：所述上游引物、下游引物和探针存在于PCR反应液A中；PCR反应液A中包括：PCRBuffer、MgCl2、dNTP/dUTP、BSA、上游引物、下游引物和探针。在本专利技术的实施例中，PCR反应液A由PCRBuffer，MgCl2，dNTP/dUTPMixture(dATP、dCTP、dGTP和dUTP混合溶液)，BSA，上游引物，下游引物和探针组成。其中10×PCRBuffer、MgCl2和dNTP/dUTPMixture均购买于宝生物工程(大连)有限公司；BSA购买于Sigma；上游引物具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，由英潍捷基公司合成；下游引物具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，英潍捷基公司合成；探针具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，探针5’端标记荧光基团6-FAM作为发光基团，3’端标记MGB作为淬灭基团，英潍捷基公司合成。根据需求取所需量，加灭菌超纯水混合均匀后即得。所得PCR反应液A中PCRBuffer为1×工作浓度；MgCl2为4.8mmol/L；dNTP/dUTPMixture200μmol/L；BSA1mg/mL；上游引物100nmol/L；下游引物100nmol/L；探针50nmol/L，所得PCR反应液A低温保存。本专利技术的试剂盒中还包括PCR反应液B、阴性对照和阳性对照；PCR反应液B中包括：TaqDNA聚合酶、UDG酶。阴性对照包括Tris-Hcl和EDTA；阳性对照为肺炎支原体质粒。在本专利技术的实施例中，PCR反应液B由TaqDNA聚合酶、UDG酶组成。本专利技术采用的TaqDNA聚合酶的酶活力为5U/μL，购买自宝生物工程(大连)有限公司；UDG酶的酶活力为5U/μL，购买自NewEnglandBiolabs公司。根据实际需求，取TaqDNA聚合酶与UDG酶按照体积比10:1进行混合，即得，配得的PCR反应液B中TaqDNA聚合酶的酶活力为4.5U/μL；UDG酶的酶活力为0.45U/μL，所得PCR反应液B低温保存。在本专利技术的实施例中，阴性对本文档来自技高网...

【技术保护点】
肺炎支原体荧光定量检测引物组，其特征在于，包括如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物。

【技术特征摘要】
1.肺炎支原体荧光定量检测引物组，其特征在于，包括如SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物和如SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物。2.肺炎支原体荧光定量检测探针，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。3.根据权利要求2所述的肺炎支原体荧光定量检测探针，其特征在于，3’端标记有MGB淬灭基团；5’端标记有6-FAM发光基团。4.肺炎支原体检测试剂盒，其特征在于，包括：SEQIDNO:1所示核苷酸序列的上游引物、SEQIDNO:2所示核苷酸序列的下游引物，和SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针。5.根据权利要求4所述的肺炎支原体检测试剂盒，其特征在于，还包括样品处理液；所述样品处理液中包括以下浓度的组分：6.根据权利要求4所述的肺炎支原体检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物和探针存在于PCR反应液A中；所述PCR反应液A中包括：PCRBuffer...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳辉，
申请(专利权)人：深圳康美生物科技股份有限公司，北京康美天鸿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44