本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开一种采用胶乳免疫比浊法检测幽门螺杆菌抗体含量的试剂盒。本发明专利技术所述试剂盒包含幽门螺杆菌抗体校准品、pH值6.5-8.5的缓冲液以及幽门螺杆菌基因重组抗原胶乳试剂。本发明专利技术所述试剂盒采用胶乳免疫比浊法检测样品中幽门螺杆菌抗体含量，灵敏度高，可达到0.10μg/ml；稳定性好，操作简单、快速；特异性强，不易受干扰；定量准确，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及应用基因重组抗原制备胶乳免疫试剂以及含有该试剂的胶乳免疫比浊法进行幽门螺杆菌抗体检测的试剂盒。
技术介绍
幽门螺杆菌，Helicobacter pylori,简称Hp,由巴里·马歇尔(BarryJ. Marshall)和罗宾·沃伦(J. Robin Warren) 二人首次发现，此二人因此获得2005年的诺贝尔生理学或医学奖。幽门螺杆菌是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌，长2. 5 4. O μ m，宽O. 5 I. O μ m。在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形。幽门螺杆菌感染是慢性活动性胃炎、消化性胃溃疡以及胃黏膜相关淋巴组织 (MALT)淋巴瘤的主要致病因素，并且与胃癌的发生密切相关，1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WH0/IARC)将幽门螺杆菌定为I类致癌原。在亚洲地区，中国内地、中国香港、越南、印度等少年幽门螺杆菌的感染率分别60%、50%、40%、70%，慢性胃炎患者的胃粘膜活检标本中幽门螺杆菌检出率可达80% 90%，而消化性胃溃疡患者更高，可达95%以上，甚至接近100%。胃癌由于局部上皮细胞已发生异化，因此其检出率高低报道不一。幽门螺杆菌的感染已是个世界性问题，对其进行准确诊断有利于控制HP传播与流行及根除HP感染治疗的监测。1983年通过胃镜取活检标本分离培养成功以来，对幽门螺杆菌感染的诊断已发展出了许多方法，包括有细菌学、病理学、血清学、同位素示踪、分子生物学等。但总的讲来，从标本采集角度看，可以分为侵袭性和非侵袭性两大类。侵入性方法主要指必需通过胃镜取活检标本检查的方法，是目前消化病学科的常规方法。它包括细菌的分离培养和直接涂片、快速尿素酶试验，药敏试验。非侵入性方法主要指不通过胃镜取活检标本诊断幽门螺杆菌标本感染的方法。这类方法包括抗体检测、抗原检测、尿素13C/14C呼气试验等。抗体检测目前已有的方法包括酶联免疫法、免疫印迹法、胶体金法和胶乳增强免疫比浊法等，为HP的流行病学调查提供了有利便捷手段。胶乳增强免疫比浊法，是将一定量的抗原或者抗体标记到一定粒径大小的胶乳颗粒上制备成胶乳溶液，与相应的抗体或者抗原溶液混合后会引起抗原抗体反应，而形成一定的浊度，检测浊度的变化从而用以判定抗体或抗原浓度的方法。幽门螺杆菌抗体检测方法则是应用幽门螺杆菌特异性抗原标记胶乳颗粒，从而检测人血清样本中相应抗体含量的一种方法。胶乳增强免疫比浊法使用自动生化分析仪，能够简便、快速、大批量且定量的进行样本检测，对于疾病的防治意义重大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服目前使用天然抗原制备胶乳试剂的缺点，天然抗原之间批次间差异大，且制备过程繁琐、周期长，提供一种使用基因重组抗原制备胶乳免疫试剂盒，以测定幽门螺杆菌抗体以及使用该试剂进行临床样本检测的方法。为实现本专利技术的目的，本专利技术提供一种采用胶乳免疫比浊法检测幽门螺杆菌抗体含量的试剂盒，包含试剂R1、试剂R2、幽门螺杆菌抗体校准品；所述试剂Rl为pH值6. 5-8. 5的缓冲液，所述试剂R2为幽门螺杆菌基因重组抗原胶乳试剂。作为优选 ，所述R2试剂中幽门螺杆菌基因重组抗原胶乳试剂与幽门螺杆菌的尿素酶B亚单位UreB、幽门螺杆菌黏附素HpaA、空泡毒素VacA、细胞毒素相关蛋白CagA、热休克蛋白HspB、鞭毛蛋白A亚单位FlaA和B亚单位FlaB中的一种特异性结合。幽门螺杆菌特异性蛋白抗原包括是尿素酶B亚单位(UreB)、幽门螺杆菌黏附素(HpaA)、空泡毒素(VacA)、细胞毒素相关蛋白(CagA)、热休克蛋白(HspB)、鞭毛蛋白A亚单位(FlaA)和B亚单位(FlaB)等。其中尿素酶B亚单位(UreB)、幽门螺杆菌黏附素(HpaA)、热休克蛋白(HspB)、鞭毛蛋白A亚单位(FlaA)和B亚单位(FlaB)几乎在所有的幽门螺杆菌中都有表达。尿素酶蛋白对细菌在体内的定植及致病发挥着重要作用。尿素酶B亚单位(ureB)是尿素酶的两个亚单位之一，已证实是幽门螺杆菌的一个重要保护性抗原。本专利技术所述胶乳为聚苯乙烯胶乳，是一种核壳形式的胶乳颗粒，其胶乳核是甲苯乙烯聚合物，胶乳壳是甲基丙烯酸甲酯聚合物，是一种亲水性胶乳。在壳的表面具有高密度的羧基基团，经活化后在水溶液中可以与预标记蛋白分子，如抗体的氨基基团反应，产生一种稳定的共价化合物。通过加入适当的表面活性剂，胶乳颗粒的表面形成机械性或电性的保护膜，可以抑制胶乳颗粒的絮凝；根据胶乳颗粒的比重，通过适当助悬剂调节缓冲液比重和粘度，能够使胶乳颗粒稳定悬浮而不会沉降。作为优选，所述缓冲液选自Tris/HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、MOPSO缓冲液、DIPSO缓冲液、HEPPS缓冲液中的一种，并含有O. 7%-0. 9% 的 NaCl、l%-6% 的 PEG 6000,0. 01%-0. 1% 的 Tween80。所述缓冲液中含有促凝剂PEG6000，质量体积百分比浓度为1%_6%，可以加快抗原抗体的免疫反应速度，缩短检测时间。并含有无机盐NaCl，可以调节离子强度，质量体积百分比浓度为O. 7%-0. 9%。作为优选，所述R2试剂中所述基因重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。在本专利技术的具体实施方式中，公开了所述的幽门螺杆菌基因重组抗原胶乳试剂的制备包括如下步骤步骤I :聚苯乙烯胶乳溶液的准备以pH为5的MES溶液分散胶乳，用EDC活化12-15分钟形成粒径为90nm-300nm，具有羧基官能团的胶乳；步骤2 =14000转/分钟，离心10分钟收集胶乳沉淀，分散胶乳，调整胶乳浓度；步骤3 :加入基因重组抗原，室温搅拌后加入封闭液，混合均匀，室温搅拌以10，OOOrpm的速度离心10-20分钟，去除上清液；步骤4 以缓冲液洗涤分散步骤3所得沉淀，加入含O. I % BSA的PB S缓冲液洗涤分散即得。作为优选，步骤2所述分散为以PBS震荡分散或超声分散。步骤3所述基因工程抗原加入胶乳溶液中后，在2小时之内通过活化的羧基与胶乳颗粒溶液化学交联致敏，形成共价抗原-胶乳复合物。步骤3所述封闭剂为O. 1% B SA的磷酸盐缓冲液，封闭胶乳颗粒表面未结合抗原的表面活性基团。更优选地，步骤3所述基因重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。本专利技术所述的试剂盒，还包含稳定剂和防腐剂所述稳定剂选自蛋白质、氨基酸、无机盐、表面活性剂、助悬剂或抗氧剂中的一种或多种；所述防腐剂选自本领域技术人员已知的适当防腐剂，包括O. 1% (g/ml)的叠氮钠、Proclin-300、庆大霉素。在具体实施例中，公开了一种制备幽门螺杆菌基因重组抗原的方法，其制备步骤包括I)步骤I :特异性抗原的基因序列合成、基因工程表达载体的构建、蛋白表达；2)步骤2 :蛋白纯化及蛋白浓度测定。 步骤I中，基因序列来源于公开的Genbank数据库；构建的基因工程载体带有选择性蛋白标签，如His、GST等。本专利技术所述校准品是一种用来与样本比较，进行结果计算和质量控制的幽门螺杆菌抗体溶液，包括PBS缓冲液、适量稳定剂、适量防腐剂以及一定浓度的幽门螺杆菌特异性抗体。在使用时用水稀释成多个不同浓度的参考校准品。校准品的浓度可以是本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用胶乳免疫比浊法检测幽门螺杆菌抗体含量的试剂盒，其特征在于，包含试剂R1、试剂R2、幽门螺杆菌抗体校准品；所述试剂R1为pH值6.5？8.5的缓冲液，所述试剂R2为幽门螺杆菌基因重组抗原胶乳试剂。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张英伟，
申请(专利权)人：深圳康美生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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