本发明专利技术提供了三个幽门螺杆菌尿素酶Ｂ亚单位的Ｔｈ细胞表位肽及编码ＤＮＡ，并提供包含此三个表位肽及额外的一个尿素酶Ｂ亚单位的Ｂ细胞表位（ＳＩＫＥＤＶＱＦ）的疫苗。其中Ｔｈ表位肽是具有下列氨基酸残基序列之一的多肽：１）具有序列表中序列２、序列３、序列７的氨基酸序列；２）将序列表中的序列２、序列３、序列７的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加而成的衍生多肽。其编码的ＤＮＡ是下列核苷酸序列之一：１）具有序列表中序列８、序列９、序列１０的核苷酸序列。２）与序列表中序列８、序列９、序列１０具有相同编码产物的核苷酸序列。包含本发明专利技术多肽的表位疫苗是具有序列表中序列１２中的氨基酸序列的蛋白疫苗。本发明专利技术多肽作为活性成分制成的疫苗或药物，可以起到清除幽门螺杆菌感染的作用，在医药领域具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药生物
，涉及来自幽门螺杆菌(Hp)的多肽、其编码DNA及应用。其中优选的3个多肽为来自尿素酶B亚单位(UreB)的辅助性T淋巴细胞(Th)表位，本专利技术涉及含有这些表位肽的组合物，该组合物可以用于治疗和(或)预防幽门螺杆菌感染。本专利技术提供了包含3个优选Th表位及一个B细胞表位(SIKEDVQF)的表位疫苗，此外本专利技术还涉及包含这些Th表位的合成肽疫苗、基因重组亚单位疫苗及核酸疫苗等。
技术介绍
1982年澳大利亚学者Warren和Marshall首先从人胃粘膜中分离培养出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)，他们的发现使得在过去的20多年中，对于溃疡病的认识和治疗发生了很大的变革。2005年10月3日，诺贝尔奖评审委员会宣布，将2005年度诺贝尔生理学和医学奖授予这两位澳大利亚科学家，以表彰他们发现了幽门螺杆菌(Hp)以及这种细菌在胃炎和胃溃疡等疾病中的作用。研究已证实Hp是慢性胃炎、消化性溃疡及胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)等疾病的重要致病因子，与胃癌的发生相关，世界卫生组织已经把Hp列为胃癌的I类致病因子。有效的治疗和根除Hp感染已成为人们关注的焦点。目前临床主要采用抗生素多联疗法治疗Hp感染，虽然可以达到85％的根除率，但存在以下缺点1、药物疗法毒副作用大；2、复杂的联合用药导致病人的依从性差；3、药物不能防止Hp的再感染；4、抗生素治疗易产生耐药性而导致治疗失败；5、对发展中国家病人而言，药物疗法在经济上也较困难。免疫接种是预防和控制感染性疾病最经济而有效的方法，鉴于Hp感染的高发病率及其与慢行胃炎、消化性溃疡以及胃癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的密切关系，如何通过免疫接种达到防治这些疾病的目的，一直是各国科研人员研究的重点问题。疫苗接种通过有效地调动机体的免疫系统，克服细菌对宿主的免疫逃避来达到预防感染和消除已感染细菌的目的，经济而简便，可在人群中大规模运用，并且对耐药细菌仍然有效，因此研究幽门螺杆菌疫苗具有重要的意义。动物实验研究表明，疫苗接种可以减少Hp在胃粘模定植，并减轻胃粘膜的炎症反应，起到预防和治疗Hp感染的作用。目前关于Hp的疫苗研究多是采用全菌疫苗或重组亚单位疫苗及核酸疫苗等，其引发的免疫应答与Hp自然感染时的免疫应答相似。Hp自然感染时体内产生强烈的细胞与体液免疫应答，但是感染仍慢性持续化甚至终身感染，说明机体已经对Hp存在免疫耐受，自然感染时产生的免疫应答不能起到保护作用，因而通过疫苗接种的方式清除Hp就必须在抗原选择以及表位水平对抗原进行改造，激发更有效的免疫应答。表位疫苗是近年随分子生物学及免疫学的进展而发展起来的一种新的疫苗形式，可以诱导机体产生特异性的免疫应答，并且其副作用轻微、安全性好，是目前疫苗研究的一个新的方向，广泛应用于病毒、肿瘤、及慢性感染性疾病的免疫预防和治疗。借鉴表位疫苗在其它慢性感染性疾病中的研究成果，以Hp表位为基础设计的疫苗有可能打破机体的免疫耐受，达到预防和治疗Hp感染的目的。细胞免疫尤其是CD4+T淋巴细胞(也称为辅助性T淋巴细胞，Th细胞)在抗Hp感染中起到了重要的作用。CD4+T淋巴细胞识别的抗原是外来抗原经抗原提呈细胞(APC)处理后与MHC□类分子结合并提呈到细胞表面的短肽，即Th表位。被Th表位激活的CD4+T淋巴细胞可以辅助B细胞及CTL细胞发挥免疫效应。在Hp感染中CD4+T除了发挥辅助功能外还直接发挥免疫效应并且介导免疫保护应用MHC I类分子敲除小鼠和MHC II类分子敲除小鼠的研究模型发现，MHC II类分子敲除的小鼠不能够对Hp的感染起到保护作用，CD4+T淋巴细胞识别的是结合到MHC□类分子上的短肽(即Th表位)，而CD8+T淋巴细胞识别的是结合到MHC□类分子上的短肽(即CTL表位)，因此提示CD4+T淋巴细胞而非CD8+T淋巴细胞对Hp感染起到了免疫保护作用。因而要激发对Hp的保护性免疫应答，必须激发机体的CD4+T淋巴细胞免疫应答。尿素酶(Urease)是Hp的主要致病因子，对Hp在人胃粘膜定居起着重要作用，在胃部的酸性环境中，一般细菌很难存活，但是Hp的尿素酶能够水解尿素而释放氨，在菌体周围形成一层“氨云”保护Hp抵抗胃酸而在胃粘膜定植，并且释放的氨能直接损害胃粘膜。尿素酶在Hp菌体中的含量高，占可溶性蛋白的6％，由A和B两个亚单位组成，其中B亚单位(UreB)为尿素酶活性亚基，在各菌株中相对保守，研究证实UreB具有很强的抗原性，是较好的Hp疫苗的候选抗原。目前关于Hp的表位研究主要是针对尿素酶的B细胞表位开展的，研究发现针对尿素酶B亚单位(UreB)不同表位的单抗有的抑制尿素酶的活性，有的则增强尿素酶的活性，有学者尝试用UreB上部分片段来制备疫苗，产生抑制尿素酶活性的中和抗体。而目前研究表明抗Hp感染的免疫保护是由CD4+T淋巴细胞介导的，因此采用免疫手段预防和治疗Hp感染必须激发机体的CD4+T淋巴细胞免疫应答，但遗憾的是目前还未有人鉴定出Hp的Th细胞表位，因此本专利技术从鉴定Hp的尿素酶B亚单位的Th表位入手，研究预防和治疗Hp感染的方法。本专利技术的思路如下最初的研究以BALB/c(H-2d)小鼠为动物模型，在BALB/c(H-2d)小鼠的动物模型上研究Hp的表位疫苗，采用生物软件预测了UreB可能H-2d限制性的Th表位，并以CD4+T淋巴细胞增殖试验进行筛选和鉴定，获得了3个UreB的Th表位肽。根据表位研究的理论，存在杂合性T细胞表位(promiscuous T cell epitope)或通用T细胞表位(universalT cell epitope)的概念，即一些辅助性T细胞表位能够与多种MHC-II类分子结合，可以较少的受MHC分子的限制。后来又提出超型和超基序的概念，超型(HLA Supertype)是指能与一种表位肽结合的多种HLA分子(人的MHC分子)，与之相对应的能与多种HLA结合的表位肽称为“超基序”(Supermotif)，用这种超基序表位制备疫苗可以克服MHC限制性的问题，获得广泛的保护性。而在小鼠的遗传背景下鉴定出的表位是否也具有这种特性，本专利技术人又收集了Hp感染患者的外周血淋巴细胞(PBMC)作为效应细胞，观察了此3个表位肽对人的PBMC的作用，发现这3个表位肽也可以刺激人的PBMC增殖。因此本专利技术的表位肽可以用来研制人或小鼠用的Hp表位疫苗，并可以用来开发预防或治疗Hp感染的多肽药物。此外本专利技术在鉴定Hp的UreB的Th表位基础上专利技术了一种基于表位肽的疫苗并提供了表位疫苗的设计方法和制备方法，动物实验表明此疫苗具有良好的免疫原性。
技术实现思路
本专利技术经过深入而广泛的研究，对Hp的UreB蛋白进行计算机软件分析的基础上，选择性的合成了7条可能诱导机体产生Th细胞免疫应答的多肽，通过CD4+T淋巴细胞增殖试验，筛选出3个Th表位肽，并对其免疫特性进行评价，发现此3个表位肽可以在BALB/c小鼠体内引发针对UreB的特异性的应答，并且此3个表位肽能够刺激Hp感染者的外周血淋巴细胞增殖，可以用于人用的疫苗及药物的开发。此外获得一种基于3个表位肽的表位疫苗，动物实验中显示了良好的免疫原性。具体内容如下一、本专利技术第一个方面，提本文档来自技高网...
【技术保护点】
三个来自幽门螺杆菌尿素酶Ｂ亚单位的辅助性Ｔｈ细胞表位肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邹全明，吴超，石云，周维英，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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