马铃薯Y病毒阳性对照品的制备方法技术

马铃薯Y病毒阳性对照品的制备方法，它涉及病毒阳性对照品的制备方法。它为了解决现有PVY病毒检测试剂盒中的阳性对照价格昂贵、保质期短以及不利于推广普及的问题。方法：一、将PVY繁殖寄主叶片和提取缓冲液混合后进行研磨，过滤得病毒汁液；二、明胶和提取缓冲液混合加热至融化，加入蔗糖，融化后倒入病毒汁液中混匀，再倒入青霉素瓶中，然后冻干，得马铃薯Y病毒的冻干粉即完成。本发明专利技术制备的马铃薯Y病毒阳性对照品价格低，是进口价格的1/3；保质期达3年以上，DAS-ELISA检测结果值达2.000以上；配合黑龙江省农业科学院生产的PVY病毒检测试剂盒使用，利于推广普及。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒阳性对照品的制备方法。
技术介绍
马铃薯是中国第四大粮食作物，然而整体生产水平却低于世界平均水平，其中最重要的原因就是病毒病严重影响了马铃薯的产量和品质。马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是危害马铃薯的重要病毒之一，分布于世界各个马铃薯产区，可通过蚜虫以非持久方式传播，导致马铃薯退化、产量降低，严重时减产可达80%以上。特别是PVY在茄科作物上往往与马铃薯X病毒(PVX)发生协生作用，加剧了病毒病的危害，造成巨大的经济损失。 目前最有效的防治措施是推广脱毒种薯并加强检测工作，有效的检测方法是保证生产安全的重要措施，国内外常规检测普遍采用病毒检测试剂盒，应用DAS-ELISA技术进行PVY检测，实验检测结果需要用病毒的阳性对照即马铃薯Y病毒冻干粉来判断结果是否准确，对实验能否顺利开展起着至关重要的作用，而该试剂盒全世界只有不足十家企业销售，目前国内PVY病毒检测几乎完全依赖进口试剂盒，价格昂贵，限制了检测技术的推广普及，从而限制了马铃薯种薯质量的提高和产业的发展。另外，进口试剂盒存在以下缺点(I)价格昂贵进口试剂盒中的阳性对照价格昂贵，每瓶需要300元左右；(2)保质期短进口试剂盒中的阳性对照保质期为I年左右，如对阳性对照的冻干粉进行稀释或者稀释后反复冻融，保质期还将大大缩短，而且检测结果值很低，不利于检测结果的判断；(3)不利于推广普及由于价格昂贵，I套马铃薯Y病毒试剂盒中只有I瓶阳性对照，由于需要多次检测，每次检测都需要用阳性对照，因此，经过反复冻融，保质期缩短，检测值低，影响检测结果。从而使马铃薯Y病毒的检测试剂盒的应用受到限制，不利于推广普及。
技术实现思路
本专利技术目的是为了解决现有PVY病毒检测试剂盒中的阳性对照价格昂贵、保质期短以及不利于推广普及的问题，而提供马铃薯Y病毒阳性对照品的制备方法。马铃薯Y病毒阳性对照品的制备方法按以下步骤实现一、将IOg的PVY繁殖寄主叶片和120mL的提取缓冲液混合后进行研磨，然后用双层纱布过滤，得到病毒汁液；二、将O. 06 O. 12g的明胶和80mL的提取缓冲液混合，加热至融化，然后加入6 IOg的蔗糖，继续加热至蔗糖融化，倒入病毒汁液中混匀，再倒入青霉素瓶中，每瓶加入I 2ml，盖上瓶塞并放入冷冻干燥机中抽干，得到马铃薯Y病毒的冻干粉，即完成马铃薯Y病毒阳性对照品的制备；其中步骤一中提取缓冲液每IOOmL由20g的PVP_40000、8· Og的NaCL、0. 2g的KH2PO4,2. 9g 的 Na2HPO4 · 12Η20、0· 2g 的 KCL、0. 2g 的 NaN3、0. 5mL 的 Tween20 和余量的蒸馏水组成。本专利技术制备的马铃薯Y病毒阳性对照品的有益效果是(1)价格低马铃薯Y病毒阳性对照每瓶价格为100元，而进口阳性对照的价格是300元左右，是进口价格的1/3 ；(2)保质期长，检测灵敏度高对产品进行了保质期、检测灵敏度的跟踪实验，经验证该产品保质期达3年以上，DAS-ELISA检测结果值达2. 000以上；(3)利于推广普及价格低廉、检测结果准确、保质期长，配合黑龙江省农业科学院生产的PVY病毒检测试剂盒使用，利于推广普及。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式马铃薯Y病毒阳性对照品的制备方法按以下步骤实现一、将IOg的PVY繁殖寄主叶片和120mL的提取缓冲液混合后进行研磨，然后用双层纱布过滤，得到病毒汁液； 二、将O. 06 O. 12g的明胶和80mL的提取缓冲液混合，加热至融化，然后加入6 IOg的蔗糖，继续加热至蔗糖融化，倒入病毒汁液中混匀，再倒入青霉素瓶中，每瓶加入I 2ml，盖上瓶塞并放入冷冻干燥机中抽干，得到马铃薯Y病毒的冻干粉，即完成马铃薯Y病毒阳性对照品的制备；其中步骤一中提取缓冲液每IOOmL由20g的PVP_40000、8· Og的NaCL、0. 2g的KH2PO4,2. 9g 的 Na2HPO4 · 12Η20、0· 2g 的 KCL、0. 2g 的 NaN3、0. 5mL 的 Tween20 和余量的蒸馏水组成。本实施方式中PVY繁殖寄主叶片的获得①在马铃薯生长季节里，田间采集有花叶或坏死症状的马铃薯叶片，带回实验室，经血清学DAS-ELISA方法检测为PVY病毒的叶片保存于-20°C冰箱，作为PVY毒源；②通过摩擦接种的方式将PVY毒源接种到PVY的繁殖寄主“黄苗榆烟”上，对接种植株从接种之日起每隔10天，用血清学DAS-ELISA方法检测，当检测结果值达2. 000以上进行采收，进行马铃薯Y病毒阳性对照品的制备。本实施方式中放入冷冻干燥机中抽干，得到马铃薯Y病毒的冻干粉的工艺过程如下I.将冷冻干燥机打开，温度调至-50°c ；2.当温度达到_50°C时，将青霉素瓶放入冷冻干燥机中抽干3小时；3. _40°C，抽干 3 小时；4. _30°C，抽干 3 小时；5. _20°C，抽干 3 小时；6.-10°C，抽干 3 小时；7. 0°C，抽干 3 小时;8. 10°C，抽干 I 小时;9. 20°C，抽干 I 小时;10. 30°C，抽干 I 小时;11.真空状态压盖；12.取出青霉素瓶。本实施方式中制备的马铃薯Y病毒阳性对照品配合黑龙江省农业科学院生产的PVY病毒检测试剂盒使用；黑龙江省农业科学院生产的PVY病毒检测试剂盒的主要成分为抗体(IgG)、酶标抗体(IgG-Ap)、样品提取缓冲液、洗漆缓冲液、包被缓冲液、酶标缓冲液、底物缓冲液、底物、马铃薯Y病毒阳性对照和阴性对照。具体实施方式二 本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中将O. Ig的明胶和SOmL的提取缓冲液混合，加热至融化，然后加入Sg的蔗糖。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。实施例马铃薯Y病毒阳性对照品的制备方法按以下步骤实现一、将IOg的PVY繁殖寄主叶片和120mL的提取缓冲液混合后进行研磨，然后用双 层纱布过滤，得到病毒汁液；二、将O. Ig的明胶和80mL的提取缓冲液混合，加热至融化，然后加入8g的蔗糖，继续加热至蔗糖融化，倒入病毒汁液中混匀，再倒入青霉素瓶中，每瓶加入I 2ml，盖上瓶塞并放入冷冻干燥机中抽干，得到马铃薯Y病毒的冻干粉，即完成马铃薯Y病毒阳性对照品的制备；其中步骤一中提取缓冲液每IOOmL由20g的PVP_40000、8· Og的NaCL、0. 2g的KH2PO4,2. 9g 的 Na2HPO4 · 12Η20、0· 2g 的 KCL、0. 2g 的 NaN3、0. 5mL 的 Tween20 和余量的蒸馏水组成。本实施例中放入冷冻干燥机中抽干，得到马铃薯Y病毒的冻干粉的工艺过程如下I.将冷冻干燥机打开，温度调至_50°C ；2.当温度达到_50°C时，将青霉素瓶放入冷冻干燥机中抽干3小时；3. _40°C，抽干 3 小时；4. _30°C，抽干 3 小时；5. _20°C，抽干 3 小时；6.-10°C，抽干 3 小时；7.0°C，抽干 3 小时；8. 10°C，抽干 I 小时;9. 20°C，抽干 I 小时;10. 30°C，抽干 I 小时;11.真空状态压盖；12.取出青霉素瓶。本实施例中制备的马铃薯Y病毒阳性对照品配合黑龙江省农业科学院生产的PVY病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
马铃薯Y病毒阳性对照品的制备方法，其特征在于马铃薯Y病毒阳性对照品的制备方法按以下步骤实现：一、将10g的PVY繁殖寄主叶片和120mL的提取缓冲液混合后进行研磨，然后用双层纱布过滤，得到病毒汁液；二、将0.06～0.12g的明胶和80mL的提取缓冲液混合，加热至融化，然后加入6～10g的蔗糖，继续加热至蔗糖融化，倒入病毒汁液中混匀，再倒入青霉素瓶中，每瓶加入1～2ml，盖上瓶塞并放入冷冻干燥机中抽干，得到马铃薯Y病毒的冻干粉，即完成马铃薯Y病毒阳性对照品的制备；其中步骤一中提取缓冲液每100mL由20g的PVP？40000、8.0g的NaCL、0.2g的KH2PO4、2.9g的Na2HPO4·12H2O、0.2g的KCL、0.2g的NaN3、0.5mL的Tween20和余量的蒸馏水组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张威，白艳菊，高艳玲，范国权，申宇，李学湛，孟宪欣，卢娜，
申请(专利权)人：黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，
类型：发明
国别省市：