本发明专利技术属于生物化学领域，提供一种检测α-珠蛋白基因缺失的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由一对特异性扩增ζ珠蛋白的引物、一对特异性扩增α1珠蛋白的引物、一对特异性扩增α2珠蛋白的引物、一对特异性扩增β-Actin基因的引物、特异性检测ζ珠蛋白的荧光探针物、特异性检测α1珠蛋白的荧光探针、特异性检测α2珠蛋白的荧光探针、特异性检测β-Actin基因的荧光探针和DNA聚合酶等组成。该试剂盒对检测缺失型α-地中海贫血具有良好的敏感性和准确性，重复性和稳定性很好，完全适用于缺失型α-地中海贫血的临床检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化学领域，具体涉及包含核酸的测定或检验方法的试剂。
技术介绍
人类α-珠蛋白基因簇位于16号染色体上，有ζ、α 、α2三个功能基因，表达 相应的ζ和α珠蛋白链，再与相应的β珠蛋白链结合，形成ζ 2 γ2(胚胎期血红蛋白Hb Portland)和α 2 β 2 (成人血红蛋HbA)。正常情况下，人类珠蛋白基因所表达的α类和 β类珠蛋白链比例适当，形成具有功能的血红蛋白四聚体。当α珠蛋白基因缺陷，导致α 链合成减少而β链相对过剩，即可导致α-地中海贫血疾病。地中海贫血(简称“地贫”) 是全球最常见、对人类健康影响最大的单基因遗传病之一，主要集中在地中海沿岸国家、东 南亚、少数非洲地区和我国南方，保守估计全世界携带者近2亿人。临床上常见α-地贫和 β-地贫。但α-地贫的人群携带率远高于β-地贫。此病无有效治疗手段，应用相应分析 技术通过人群筛查及产前诊断阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。导致α 链合成减少的基因缺陷主要是α珠蛋白基因缺失，其缺失数目是α-地贫临床表现及分型 的依据。正常个体为2个α 和2个α 2珠蛋白基因，其中缺失1个为静止型，缺失2个 为标准型，缺失3为HbH病，4个均缺失的为Hb Bart' s胎儿水肿综合征。在α-珠蛋白基因缺失型分子诊断和产前诊断的临床实践中，采用相应的技术方 法，分析是否存在某种缺失类型而间接推导α珠蛋白基因的缺失情况。检测技术发展历程 中，准确性高但操作繁琐、费时费力的Southern杂交技术，不适合常规检测，目前实验室已 基本不用。随着上世纪80年代末PCR技术的专利技术，此技术很快被应用于α-地贫基因缺失 分子诊断。在缺失区域两侧设计一对引物，正常情况下两引物间片段很长不属于PCR有效 扩增范围，而当缺失时距离变短则能扩增出特异性的扩增产物，此即目前常规使用的跨越 裂点PCR技术(也称裂口 PCR，gap-PCR)。以PCR技术的高灵敏性及相对易操作特点，结合 当时为数很少的几种已知缺失类型，gap-PCR分子诊断方法尚能基本满足需求。随着α-地 贫分子机制及分子流行病学的研究与发展，新的缺失类型陆续发现，目前缺失种类已超过 30种。并且，α珠蛋白基因簇具有高GC含量及高度同源的结构特征，加上各缺失类型的缺 失范围不相同、缺失长度不一，有的缺失类型断裂点不明，这也就意味着目前的gap-PCR方 法，必须采用不同的检测体系和检测条件，逐一对各种缺失类型分别进行分析，以确定受检 者是否有基因缺失及缺失类型。另外，PCR技术具有高灵敏性，极微量的外源污染，尤其是 产前诊断中的母源性污染，就能导致基于gap-PCR方法定性分析的假阳性诊断结果，造成 严重后果。总的来说，目前常规使用的gap-PCR方法，检测成本高、工作量大、操作繁琐、检 测通量小，难以实现自动化和标准化，且存在难以解决的假阴性及假阳性技术瓶颈，不能满 足当前缺失型α-地贫的大规模人群筛查和临床常规分子诊断需要。针对gap-PCR应用于α -珠蛋白基因缺失分子诊断上的局限，近年来对gap-PCR 方法进行改进。例如多重gap-PCR方法，即在同一 PCR反应体系里加上两对以上特异性引 物，同时检测几种已知缺失类型，但由于各缺失类型的缺失范围与长度不同，各自的PCR体系及扩增条件也就不同，所以多重gap-PCR也只是局限于极少的、PCR扩增体系与条件基本 相同的缺失类型；也有学者报道应用DHPLC(变性高效液相色谱)作为后PCR产物分析处理 方式，对-α 3 7和-α 4 2等缺失类型进行分子诊断，以提高检测通量；还有报道以熔链分析 作为gap-PCR产物分析处理方式，检测SEA和THAIL两种缺失类型。最近，有报道应用实时 荧光PCR对SEA和/或Hb Bart' s胎儿水肿综合征进行分子诊断，其扩增与检测一次性闭 管完成，无凝胶电泳等后PCR处理，虽然只局限于某一种缺失类型的检测，但其具有操作相 对简单、可实现标准化及大规模检测等技术优势。总的来说，一些分子生物学新技术，已相 继应用到缺失型α-地贫的分子诊断中，在方法学上虽然有一定进展，但基本上都属于针 对各种缺失类型进行定性分析的方法学改进，仍存在假阴性与假阳性等技术瓶颈，其操作 可行性、检测通量等方面不能满足当前大规模人群筛查及常规检测的需要。随着目前以降低地贫患儿出生率为目标的预防计划与措施的相继实施，以及地贫 分子机制及分子流行病学的深入研究，准确可靠、简单实用、能实现自动化和标准化、适合 大规模人群筛查和常规分子诊断的高通量检测技术与方法，是这些项目实施的技术支撑条 件，更是当前地中海贫血遗分子诊断的迫切需要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种检测α -珠蛋白基因缺失的荧光定量PCR试 剂盒，该试剂盒可以直接定量检测α珠蛋白基因簇中ζ、α 1、α 2三个功能基因的拷贝数 以及拷贝数的变化。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是一种检测α -珠蛋白基因缺失的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括扩增引物和 荧光探针，其特征在于，所述的扩增引物为，一对特异性扩增ζ珠蛋白的引物、一对特异性 扩增α 1珠蛋白的引物、一对特异性扩增α 2珠蛋白的引物和一对特异性扩增β-Actin基 因的引物；所述的荧光探针为，特异性检测ζ珠蛋白的荧光探针、特异性检测α 1珠蛋白的 荧光探针、特异性检测α 2珠蛋白的荧光探针和特异性检测β-Actin基因的荧光探针，其 中，(1)所述的一对特异性扩增α1珠蛋白的引物中，上游引物序列为5，-CGTCGTGTACTTGTGTGATGGTTAGA-3，(SEQ NO. 1)， 下游引物序列为5，-CGTCGTAAACAGGTAAACAAAGCAATAG-3，(SEQ NO. 2)；(2)所述的一对特异性扩增α2珠蛋白的引物中，上游引物序列为5'-GTCGTGTACAACTTCCTATTCTCAGTG-3，(SEQ NO. 3)， 下游引物序列为5，-CGTCGGGAAGACTTGCTAGGTAAATACT-3，(SEQ NO. 4)；(3)所述的一对特异性扩增ζ珠蛋白的引物中，上游引物序列为5'CCGTCCAGGAGGCTGCTTACT-3，(SEQ NO. 5)， 下游引物序列为5，-GGTGCTCCTTATTCATTTCAGAATCAC-3，(SEQ N0. 6)；(4)所述的一对特异性扩增β-Actin基因的引物中，上游引物序列为5’-GGTCCCTACTGTGCACCTACTTAATACAC-3，(SEQ Ν0. 7)， 下游引物序列为5，-GCTGACACTGGCTCGTGTGAC-3，(SEQ N0. 8)；(5)所述的特异性检测α1珠蛋白的荧光探针为5，-FAM-CTGCCTACCTCCCAGAGGAGGTTGAATGC-BHQ1-3，(SEQ NO. 9)；(6)所述的特异性检测α 2珠蛋白的荧光探针为5’ -HEX-TCTCCCCTGCATCCCTTTCAGC-BHQ1-3，(SEQ NO. 10)；(7)所述的特异性检测ζ珠蛋白的荧光探针为5' -Cy5-CCCTGCTCCTCTGGTTTCCCC-BHQ2-3，(SEQ NO. 11)；(8)所述的特异性检本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测α－珠蛋白基因缺失的荧光定量ＰＣＲ试剂盒，该试剂盒包括扩增引物和荧光探针，其特征在于，所述的扩增引物为，一对特异性扩增ζ珠蛋白的引物、一对特异性扩增α１珠蛋白的引物、一对特异性扩增α２珠蛋白的引物和一对特异性扩增β－Ａｃｔｉｎ基因的引物；所述的荧光探针为，特异性检测ζ珠蛋白的荧光探针、特异性检测α１珠蛋白的荧光探针、特异性检测α２珠蛋白的荧光探针和特异性检测β－Ａｃｔｉｎ基因的荧光探针，其中，（１）所述的一对特异性扩增α１珠蛋白的引物中，上游引物序列为：５’－ＣＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＴＧＴＧＴＧＡＴＧＧＴＴＡＧＡ－３’（ＳＥＱ ＮＯ．１），下游引物序列为：５’－ＣＧＴＣＧＴＡＡＡＣＡＧＧＴＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧ－３’（ＳＥＱ ＮＯ．２）；（２）所述的一对特异性扩增α２珠蛋白的引物中，上游引物序列为：５’－ＣＧＴＣＧＴＧＴＡＣＡＡＣＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＴＧ－３’（ＳＥＱ ＮＯ．３），下游引物序列为：５’－ＣＧＴＣＧＧＧＡＡＧＡＣＴＴＧＣＴＡＧＧＴＡＡＡＴＡＣＴ－３’（ＳＥＱ ＮＯ．４）；（３）所述的一对特异性扩增ζ珠蛋白的引物中，上游引物序列为：５’－ＣＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＴＡＣＴ－３’（ＳＥＱ ＮＯ．５），下游引物序列为：５’－ＧＧＴＧＣＴＣＣＴＴＡＴＴＣＡＴＴＴＣＡＧＡＡＴＣＡＣ－３’（ＳＥＱ ＮＯ．６）；（４）所述的一对特异性扩增β－Ａｃｔｉｎ基因的引物中，上游引物序列为：５’－ＧＧＴＣＣＣＴＡＣＴＧＴＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＡＡＴＡＣＡＣ－３’（ＳＥＱ ＮＯ．７），下游引物序列为：５’－ＧＣＴＧＡＣＡＣＴＧＧＣＴＣＧＴＧＴＧＡＣ－３’（ＳＥＱ ＮＯ．８）；（５）所述的特异性检测α１珠蛋白的荧光探针为：５’－ＦＡＭ－ＣＴＧＣＣＴＡＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＧＧＴＴＧＡＡＴＧＣ－ＢＨＱ１－３’（ＳＥＱ ＮＯ．９）；（６）所述的特异性检测α２珠蛋白的荧光探针为：５’－ＨＥＸ－ＴＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＴＣＣＣＴＴＴＣＡＧＣ－ＢＨＱ１－３’（ＳＥＱ ＮＯ．１０）；（７）所述的特异性检测ζ珠蛋白的荧光探针为：５’－Ｃｙ５－ＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＣＣ－ＢＨＱ２－３’（ＳＥＱ ＮＯ．１１）；（８）所述的特异性检测β－Ａｃｔｉｎ基因的荧光探针为：５’－ＲＯＸ－ＣＡＡＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＣＡＣＣＡＧＣＣＴ－ＢＨＱ２－３’（ＳＥＱ ＮＯ．１２）。２、根据权利要求１所述的荧光定量ＰＣＲ试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括Ｐｒｅｍｉｘ ＥｘＴａｑＴＭ、二氯化镁和ｄＮＴＰＳ。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周万军，熊符，徐湘民，赵镇，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：81
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