禽流感病毒通用型套式荧光ＲＴ－ＰＣＲ检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种高效率、敏感性高的禽流感病毒通用型套式荧光ＲＴ－ＰＣＲ检测方法及检测试剂盒。该方法利用两套ＰＣＲ引物（１对外侧引物和１对内侧引物）进行两轮ＰＣＲ扩增的方法，即将外侧引物进行ＰＣＲ扩增后的产物作为内侧引物进行ＰＣＲ扩增的模板，内侧引物与模板ＤＮＡ的结合位点处于外侧引物扩增出的ＤＮＡ片段内侧，套式ＰＣＲ对减少或消除非特异性扩增及提高灵敏度非常有效。本发明专利技术相比于普通检测方法难以检测到的浓度极低的模板（１个或数个ｃｏｐｉｅｓ），能大大增加扩增的效率和忠实性，对环境样品中极微量靶基因的扩增非常有效，十分有利于鱼类养殖水体中的禽流感病毒微量模板的扩增，能完全满足鱼塘养殖用水中禽流感病毒检测的敏感性和特异性的要求。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种禽流感病毒通用型套式荧光ＲＴ－ＰＣＲ检测方法，其特征在于，包括以下步骤：Ａ：取待测样品提取模板ＲＮＡ；Ｂ：设立阳性对照和阴性对照，按照配置好的反应体系，用外引物（Ｐ１、Ｐ２）进行一步法ＲＴ－ＰＣＲ，所述外引物（Ｐ１、Ｐ２）的序列分别为：Ｐ１：５’－ＴＡＴＴＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＴＡ－３’Ｐ２：５’－ＧＴＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＧＴＡＴＴ－３’；Ｃ：以上述一步法ＲＴ－ＰＣＲ产物为模板，将内引物（Ｐ３、Ｐ４）及探针和反应组分置于荧光ＰＣＲ仪中进行荧光ＰＣＲ扩增反应，所述内引物（Ｐ３、Ｐ４）及探针序列分别为：Ｐ３：５’－ＣＧＧＡＣＧＡＡＡＡＧＧＣＡＡＣＧＡ－３’Ｐ４：５’－ＣＡＴＴＧＴＣＴＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＴＣＣＴ－３’探针：Ｆａｍ－５’－ＣＧＡＴＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＴＧＡＣＡ－３’－Ｅｃｌｉｐｓｅ；Ｄ：反应结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和ＣＴ值判定结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨素，沙才华，廖明，徐海聂，廖秀云，
申请(专利权)人：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：44[]