禽流感病毒PA基因突变及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药和基因工程领域，涉及一种检测禽流感病毒PA基因突变位点的方法，该方法的核心是检测H7N9禽流感PA蛋白第356位氨基酸残基。本发明专利技术还提供了相应的检测试剂盒。本发明专利技术的检测禽流感病毒PA基因突变位点的方法，操作简便快速，结果判定准确、可靠，成本低，投资少。本发明专利技术可以广泛应用于监测人感染H7N9病毒在鸟类、家禽和环境中的涵盖情况，并且其也可监测其他具有潜在传播到人能力的禽流感病毒，为国家相关部门处理被感染的家禽和候鸟，跟踪病毒迁移情况和监控潜在的禽-人传播及疫情爆发提供重要依据。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于生物医药和基因工程领域，涉及一种检测禽流感病毒PA基因突变位点的方法，该方法的核心是检测H7N9禽流感PA蛋白第356位氨基酸残基。本专利技术还提供了相应的检测试剂盒。本专利技术的检测禽流感病毒PA基因突变位点的方法，操作简便快速，结果判定准确、可靠，成本低，投资少。本专利技术可以广泛应用于监测人感染H7N9病毒在鸟类、家禽和环境中的涵盖情况，并且其也可监测其他具有潜在传播到人能力的禽流感病毒，为国家相关部门处理被感染的家禽和候鸟，跟踪病毒迁移情况和监控潜在的禽-人传播及疫情爆发提供重要依据。【专利说明】禽流感病毒PA基因突变及其应用
本专利技术属于生物医药和基因工程领域，涉及一种禽流感病毒PA蛋白的基因突变 和检测该PA基因突变的方法，以及此突变在预测和监控禽流感病毒从禽到人传播和疫情 流行中的应用。
技术介绍
最近一种新型的H7N9禽流感IAV被鉴定为致病的病原体。2013年3月31日首先 报道了这个人类新亚型的病毒，到2013年5月，在中国东部已经有128例确诊H7N9病例， 其中24例患者死亡。系统发育分析表明，H7N9病毒的H7和N9基因可能源自浙江省鸭子 中的H7病毒基因和在候鸟的N9病毒，内部基因可能来源于从鸡和鸟类分离的H9N2亚型禽 流感病毒。 目前，在中国感染地区街市的家禽和环境样本中可以检测到H7N9病毒，这再次表 明感染了H7N9的家禽可能是人类感染的重要来源之一。更引人注目的是，这些人H7N9病 毒中已出现了适应哺乳动物宿主（包括人类）的基因突变。目前普遍认为，禽流感的血凝 素（HA)蛋白和聚合酶亚基（PA，PB1和PB2)的突变是感染哺乳动物和人类的主要致病因 素，例如HA-Q226L突变使得H5N1禽流感能够结合人型受体，可通过空气在哺乳动物之间传 播。PB2-E627K突变的禽流感病毒在哺乳动物和小鼠体内毒力显著增加。目前在H7N9禽 流感中也发现了类似的位点突变，但这些突变并不存在于所有的从患者体内分离到的H7N9 病毒株中。 当前，虽然流行病学数据还未表明H7N9禽流感病毒可出现人际间传播，但并不能 完全排除发生直接人传人的可能。特别是最新的研究报道该病毒已可通过飞沫途径有效的 传播。由于该病毒在冬季或今后再次爆发的可能性较大，因此对活禽及其市场等环境的早 期监控具有重要的意义，其有效的实施可在预防和控制新疫情的爆发和传播，避免人民的 生命财产损失上起到重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种检测禽流感病毒PA基因突变位点的方法。 本专利技术的另一个目的在于提供一种检测禽流感病毒PA基因突变位点的试剂盒。 人们普遍认为，血凝素（HA)蛋白和突变聚合酶亚基（PA，PB1和PB2)的突变是感 染哺乳动物和人类的主要致病因素。例如，HA-Q226L使得突变H5N1IAV是能够结合人型受 体，成为空气中的在哺乳动物之间的传播。PB2-E627K8替换与改进的复制的禽流感病毒在 哺乳动物和在小鼠的毒力增加。 本专利技术人先前的研究工作中，比较了人类和禽类禽流感病毒的宿主特异性基因标 志。 1(l'n通过比较来自不同地区，不同时间的人类及禽类流感A(H7N9)和A(H9N2)序列发 现，在47个宿主特异性基因图谱中，H7N9病毒只含有4个宿主特异性基因位点，一个位于 PB2 基因（PB2-627K)，另外 3 个位于PA基因（PA-100A，PA-356R，andPA-409N)。 本专利技术特别感兴趣的是PA-356R这个基因标志，这是因为哺乳动物中H5N1病毒中 的PA-353R位点与增强病毒毒力有关。本专利技术进一步分析了目前所有可用的A(H7N9) 19株 从被感染的患者中分离的A(H7N9)序列。结果显示，所有19株A(H7N9)株PA序列均含有 人类特征性基因标志PA-356R(表1)，而其他位点则是含有部分是禽类特征性基因标志，对 应PA-409S，PA-100V，PB2-627E这三个位点基因标志率分别为3/19, 3/21，5/21。有趣的是， 所有的目前分离到的H5N1病毒株均含有禽类特异性基因标志PA-356K，这暗示了A(H7N9) 不同于A(H5N1)禽流感，它是通过整合了A(H9N2)的内核基因来获得PA-K356R突变。 本专利技术进一步分析了数据库中所有禽流感A(H7N9)和A(H9N2)株序列。特别引起 注意的是，所有在2013年在中国分离到的29株禽流感A(H7N9)株和在2012年四株禽流感 A(H9N2)株（总共6株）同样含有人类特异性基因标志PA-356R(表1)。 然而，来自中国禽流感（H9N2)株在2012年之前主要的宿主基因标志为PA-356K， 而不是PA-356R(在2012年之前没有在中国分离出过禽类H7N9株）。而在此之前，禽流感 A(H7N9)和A(H9N2)PA-356R在 2008 年仅有 1/39 (2. 6 % )，2009 年为 5/54 (9. 3 % )，2010 年 为1/15(6.6% )的检出率，其中6株是从韩国获得，1株在印度获得（表1)。大多数的禽流 感（H9N2)株在2012年之前主要的宿主特异性基因标志为PA-356K。 基于这些发现，PA-356R可以作为一个独特的在中国家禽中分离出的病毒禽流感 A(H7N9)基因标记，H7N9在2013年有可能得到从鸟到向人传播的相关基因片段，而这些基 因片段主要存在于禽流感019N2)病毒，在2012年和2013年之间中国的长三角地区的家禽 及鸟类中传播。随后，获得了跨物种传播能力的H7N9病毒在2013年引起中国流感爆发。编 码人类基因标志的PA-356R可能在2008年到2010年的韩国分离到的小部分A (H9N2)禽流 感毒株中已经存在，这些基因片段可能在2010年和2012年之间通过候鸟传播到了中国长 江三角洲地区的家禽中。 分析禽流感病毒H5N1IAV聚合酶PA亚基的晶体结构（PDB:3CM8)，结果表明， PA-353R与PA-356K均位于PA蛋白的一个短的loop环中（残基349-363)。虽然这区域的 病毒感染和发病的确切功能还没有被定义，但是很显然PA-353R与病毒在哺乳动物的毒力 增强有关。将H5N1IAVS的PA-353位替换成精氨酸可以增强在哺乳动物中的聚合酶活性和 病毒复制的活性。同样，位于该区域的PA-356RH7N9病毒的PA蛋白loop区可能也有类似 的H5N1禽流感病毒具有相似的功能，PA-353R可以使得在哺乳动物，人类和/或禽鸟传播 人类的毒力增加有关。 与高致病性H5N1禽流感病毒相比有较大不同，H5N1禽流感病毒杀死了数以百万 计的鸟类，H7N9病毒很难监控低致病性鸟类。因为虽然它对于人类是高毒力IAVS，但是这 种病毒不会杀死鸟类或家禽。没有准确的动物监测数据，农业部门很难决定活禽市场是否 应该被关闭，或者是否可能感染的家禽或不应该牺牲。卫生当局也很难与活家禽有接触的 人是否应该被监控。 目前，用RT-PCR法检测HA和NA基因或多个基因的基因组测序是监控动物病毒的 常规检测方法。15然而该法是非常耗时和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测禽流感病毒PA基因突变位点的方法，其特征在于，所述的方法是检测H7N9禽流感PA蛋白第356位氨基酸残基。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姜世勃，陈力，陆路，徐巍，王蕾，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31