基于液相芯片检测流行性造血器官坏死病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于液相芯片检测流行性造血器官坏死病毒的方法。本发明专利技术提供了辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的特异引物对，由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。本发明专利技术还保护辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的引物探针组合物，由所述特异引物对和探针T1组成；所述探针T1的核苷酸序列如序列表的序列3所示。采用本发明专利技术提供的特异引物对鉴定流行性造血器官坏死病毒具有良好的特异性。采用本发明专利技术提供的引物探针组合物结合液相芯片鉴定流行性造血器官坏死病毒，具有特异性好、灵敏度高、操作简便、所需时间短、不污染环境、不存在对人的健康威胁，可以进行高通量检测的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的引物对、引物探针组合物以及它们的应用，具体涉及。
技术介绍
流行性造血器官坏死病(Epizootic hematopoietic necrosis, EHN)是引起红鳍鲈、欧鲶、虹鳟和鮰鱼幼鱼和成鱼出现内脏坏死，以至死亡的一种鱼类传染病。流行性造血器官坏死病是由流行性造血器官坏死病毒(EHNV)引起的。EHN多在春季或早夏时发生，表征如下:鱼游动异常，有时沿螺旋游至水体表面；鳍条基部多出现出血点，头部发红，靠近骨骼的肌肉发白；肝脏处出现多个直径1-3_的灰白色病灶；脾脏发红、肿大、呈凝胶状；鳃部充满杂质；有些患病成鱼在缥和肾脏处的腹膜严重充血。鉴于EHN的严重危害性，世界动物卫生组织(OIE)将该病列为必须申报疫病之一。因此，迫切需要建立快速、灵敏、准确的检测方法。 目前，EHNV的检测主要依靠免疫荧光、ELISA、聚合酶链式反应(PCR)和核酸杂交这几种技术。免疫荧光操作繁琐，检测周期长，且灵敏度低。ELISA需要用进口检测试剂，进口试剂和试剂盒特别昂贵，且使用时必须提前2个月左右定货，会严重影响检测进程。核酸杂交具有特异性强、敏感性高的优点，但相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测。PCR比较快速、灵敏，但是需要进行琼脂糖凝胶电泳并通过溴化乙锭染色观察结果，溴化乙锭是致癌物，对人体和环境有危害，交叉污染问题比较严重。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的引物对、引物探针组合物以及它们的应用，具体涉及。本专利技术提供了辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的特异引物对，由序列表的序列I所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。本专利技术还提供了辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的引物探针组合物，由所述特异引物对和探针Tl组成；所述探针Tl的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述特异引物对或所述引物探针组合物可用于制备辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的试剂盒。所述特异引物对或所述引物探针组合物可用于辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒。本专利技术还保护一种辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的试剂盒，包括所述特异引物对或所述弓I物探针组合物。本专利技术还提供了一种辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的方法，包括如下步骤:以待测病毒的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增；如果所述PCR扩增得到了扩增产物，待测病毒为候选的流行性造血器官坏死病毒；如果所述PCR扩增没有得到扩增产物，待测病毒为候选的非流行性造血器官坏死病毒。所述扩增产物的大小可为100-250bp之间，具体可为179bp。所述待测病毒为对虾白斑病病毒或流行性造血器官坏死病毒。本专利技术还提供了另一种辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的方法，包括如下步骤:以待测病毒的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增后与所述探针Tl进行杂交，如果杂交结果为阳性待测病毒为候选的流行性造血器官坏死病毒，如果杂交结果为阴性待测病毒为候选的非流行性造血器官坏死病毒。所述待测病毒为对虾白斑病病毒或流行性造血器官坏死病毒。所述辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的方法具体包括如下步骤(液相芯片法):(I)以待测病毒的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增；(2)制备微球悬液①将表面羧基化的荧光编码微球漩涡振荡20s，取75 μ L (约含3 X IO6个微球)置于1.5mL离心管中，IOOOOg离心Imin,弃上清；②在步骤①的离心管中加入50 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(ρΗ4.5)，漩涡混合，超声波处理30-60秒(400W的功率，每超声9秒停6秒)；③在步骤②的离心管中加入1.0nmol所述探针Tl，漩涡混合；④在步骤③的离心管中加入2.5 μ L碳二亚胺溶液(碳二亚胺溶液的制备方法:将IOmg碳二亚胺粉末加入1.0mL的灭菌纯水，现用现配)充分混匀，室温避光孵育30min ；⑤在步骤④的离心管中加入2.5μ L碳二亚胺溶液(碳二亚胺溶液的制备方法同上)充分混匀，室温避光孵育30min ；⑥在步骤⑤的离心管中加入1.0mL0.02g/100mL Tween-20水溶液，混匀，IOOOOg离心Imin,弃上清；⑦在步骤⑥的离心管中加入1.0mL0.1g/1OOmL SDS水溶液，混匀，IOOOOg离心Imin,弃上清；⑧在步骤⑦的离心管中加入IOOyL 0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(ρΗ4.5)，重悬，得到微球悬液；(3)将步骤(I)的产物和步骤(2)得到的微球悬液进行杂交即为实验组，用TE缓冲液代替步骤(I)的产物即为对照组；将杂交体系混合均匀后于98°C变性lOmin，然后在与杂交温度相同的温度下孵育15min，18000g离心2min，弃上清；然后加入50 μ L用I X TMAC杂交液稀释至500倍体积的SA-PE，48°C -54°C (优选为54°C)杂交15min，18000g离心2min，弃上清；然后加入50 μ L IX TMAC杂交液，漩涡混合使微球重悬，置于BD FACSArray液相芯片仪中进行分析；如果LQRR ^ 3，检测结果为阳性；如果LQRR < 2，检测结果为阴性；LQRR=MFIS/MFIB, MFIS为实验组的荧光强度中位值，MFIB为对照组的荧光强度中位值。PCR 扩增的反应程序:94°C 2min ；94°C 30sec,56°C 30sec,72°C 30sec, 30 个循环；72°C延伸 5min ;4°C保温。液相芯片是一种新型快速检测技术，集流式细胞术、纳米荧光微球、荧光信号数字处理和传统化学发光技术为一体，具有所需检测样本量少、检测周期短的优点。`采用本专利技术提供的特异引物对鉴定流行性造血器官坏死病毒具有良好的特异性。采用本专利技术提供的引物探针组合物结合液相芯片鉴定流行性造血器官坏死病毒，除了良好的特异性外，还具有灵敏度高、操作简便、所需时间短、不污染环境、不存在对人的健康威胁，可以进行高通量检测的优点。本专利技术非常适合对进出境水生动物进行检测。附图说明图1为实施例2中的电泳图。图2为杂交温度为54°C时，BD FACSArray液相芯片仪的输出图谱。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。DNA 提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.4.0):大连宝生物公司，D824A。PCR试剂盒(PCR Amplification Kit):大连宝生物公司，货号为 R011。RNA 提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer4.0):大连宝生物公司，货号为 DV819A。RT-PCR 试剂盒(PrimeScript RT-PCR Kit):大连宝生物公司，货号为DRR014S。流行性造血器官坏死病毒(EHNV)，DNA病毒，参考文献:黄辉三；李明玉；母尹楠等流行性造血器本文档来自技高网...

【技术保护点】
辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的特异引物对，由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。

【技术特征摘要】
1.辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的特异引物对，由序列表的序列I所示的单链DNA分子和序列表的序列2所不的单链DNA分子组成。2.辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的引物探针组合物，由权利要求1所述特异引物对和探针Tl组成；所述探针Tl的核苷酸序列如序列表的序列3所示。3.权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述引物探针组合物在制备辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的试剂盒中的应用。4.权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述引物探针组合物在辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒中的应用。5.辅助鉴定流行性造血器官坏死病毒的试剂盒，包括权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述引物探针组合物。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：方绍庆，尹伟力，王颖，赵玉然，刘宁，许红岩，段效辉，耿金培，李金庆，
申请(专利权)人：中华人民共和国烟台出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：