用于检测高危型HPV 的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性检测样品中是否存在HPV16亚型和18亚型的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)如SEQ?ID?NO:1和2所示的用于PCR扩增HPV16亚型DNA的第一引物对；(ii)如SEQ?ID?NO:3和4所示的用于PCR扩增HPV18亚型DNA的第二引物对；以及(iii)如SEQ?ID?NO:5和6所示的用于与PCR扩增产物杂交的一对探针或与SEQ?ID?NO:5和6所示的序列互补的序列的一对探针。本发明专利技术在一个实验点上同时检测16型和18型HPVDNA，只要检测样本里包含HPV16型和/或18型DNA并达到一定的检测限，检测结果即为阳性。试剂盒的反应简单，灵敏度高，通量高，并且可减少实验操作时间和杂交试剂用量，适用于HPV16、18型感染的临床筛查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于检测高危型HPV的试剂盒和方法，尤其是一种用于检测HPV16亚型和HPV18亚型的试剂盒和方法。
技术介绍
临床研究表明，人类乳头状瘤病毒(HPV)是目前为止唯一明确的致癌病毒，其持续性感染将导致宫颈癌变和子宫颈上皮内瘤变。经过近30年的大量研究表明，宫颈的高危型HPV持续感染是引起宫颈癌及癌前病变的直接原因。预防高危型HPV感染就可以预防宫颈癌前病变，从而避免晚期癌症发生。高危型HPV中，其中，HPV16(53%)、HPV18(15%)等的感染是引起宫颈癌变的重要因素，因此进行该病毒的筛查是预防子宫疾病和宫颈癌的最有效方法。目前，临床上应用的HPV DNA检测方法主要有以下几种:杂交捕获检测法、PCR检测法、PCR结合杂交检测法和ELISA方法。杂交捕获检测法的代表产品为QIAGEN(Gaithersburg，Inc.)公司的高危型人乳头瘤病毒检测试剂盒(Hybrid Capture2 High-Risk HPV DNA Test)。此种方法检测价格昂贵，无法在基层医院普及应用，且该产品只能对13种高危型HPV的DNA进行定性检测，检测覆盖病毒型别较少，在HPV筛查检测中应用有一定的局限性。 近年来发展了实时荧光PCR(Real-time PCR)检测方法。实时荧光PCR技术使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对PCR扩增产物进行实时动态检测和自动分析结果，PCR与杂交共享的方法避免了单纯使用PCR所造成的假阳性，进一步提高了检测的特异性。但此种方法检测HPV的型别一般只包括一部分常见高危型别的HPV，检测型别覆盖范围较小，且配套设备价格昂贵，同样无法在基层医院普及。PCR结合杂交检测法进行基因诊断灵敏、快捷，结果可靠。核酸杂交法的灵敏度和特异性均显着高于传统的检测方法，并且可应用特异性探针对HPV分型，已有的商业化检测试剂盒产品包括人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)和人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒。这些试剂盒在检测的同时还对所检测到的病毒进行分型，方便临床诊断，但由于HPV 16和18两种亚型是最主要的高危病毒亚型，因此对于每份样品如果都使用能够区分出各种亚型的试剂盒或基因芯片来检测的话，无疑会造成资源的浪费。此外，还有欧洲Innogenetics的INNO-LiPA HPV分型试剂盒、罗氏(Roche)的Line Blot HPV试剂盒，是以条形膜作传统杂交分型，也相当费时而手段繁复。以ELISA类型分析方法如罗氏(Roche)的AMPLICOR HPV MWP试剂盒因为稳定性、灵敏度等问题，未能得到广泛应用。有鉴于此，需要提供一种更加便利、实用、稳定和节约型的检测方法和试剂盒。
技术实现思路
本专利技术一方面提供了一种特异性检测样品中是否存在HPV 16亚型或18亚型的试剂盒，所述试剂盒包括:(i)如SEQ ID NO:1和2所示的用于扩增HPV16亚型DNA的第一引物对；(ii)如SEQ ID N0:3和4所示的用于扩增HPV18亚型DNA的第二引物对；以及(iii)如SEQ ID N0:5和6所示的用于与扩增产物杂交的一对探针或与SEQ ID N0:5和6所示的序列互补的序列的一对探针。在优选的实施方式中，本专利技术的试剂盒中还包含(iv)如SEQ ID NO: 7和8所示的用于扩增人类β_球蛋白基因的片段的引物对；以及如SEQ ID NO: 9所示的用于与人类β-球蛋白扩增产物特异性结合的探针。在优选的实施方式中，所述引物均在5’端标记有生物素。在优选的实施方式中，所述探针均在5’端连接有氨基。在优选的实施方式中，本专利技术的试剂盒中还包含(V)如SEQ ID NO: 10所示的一段3’端经生物素修饰的随机寡核苷酸探针。在优选的实施方式中，所述样品为宫颈脱落细胞、液基细胞学标本或石蜡组织切片。在优选的实施方式中，所述PCR扩增所用的模板DNA为5 ng至100 ng。在优选的实施方式中，所述PCR的扩增条件为95°C 9 min ； 95°C 20 s、55°C 30s ,72°C 30 s，共 40 个循环；72°C 5 min ；4 °C保存。在优选的实施方式中，所述PCR扩增的各步变温速率为1°C /S。本专利技术另一方面提供了一种检测样品中是否存在HPV 16亚型和18亚型的方法，所述方法包括:(a)提取样品的DNA ； (b)使用SEQ ID NO:1至4的引物对所提取的DNA进行PCR扩增；(c)利用导流杂交技术使用SEQ ID NO: 5和6的探针与PCR扩增的产物进行杂交；以及(d)通过显色反应识别是否发生杂交反应从而确定样品中是否存在HPV 16亚型和18亚型。在优选的实施方式中，步骤(b)还包括使用SEQ ID NO: 7和8所示的用于扩增人类β_球蛋白基因的片段的引物对，并在步骤(c)中使用如SEQ ID NO: 9所示的用于与人类β_球蛋白扩增产物特异性结合的探针。在优选的实施方式中，步骤(C)还包括使用SEQ ID NO: 10所示的一段3’端经生物素修饰的随机寡核苷酸探针作为对照。本专利技术方法和试剂盒采用PCR结合杂交检测法，PCR技术扩增HPV DNA,扩增产物通过导流杂交技术与低密度DNA芯片进行反向点杂交，检测结果转化成肉眼可识读信号。此方法和试剂盒用于检测样本中是否含有高危型(包括16型和18型)HPV DNA，但对HPV不作具体分型。本专利技术在一个实验点上同时检测16型和18型HPVDNA，只要检测样本里包含HPV16型和/或18型DNA，并达到一定的检测限，检测结果即为阳性。试剂盒的反应简单，灵敏度高，通量高，并且减少实验操作时间和杂交试剂用量，适用于HPV16、18型感染的临床筛查。附图说明下面结合附图和具体实施方式，对本专利技术及其有益技术效果进行进一步说明。图1显示HPV检测阴性和阳性结果判读信号位置。图2是本专利技术的一个实施例中HPV16、18的临床样本检测结果。图3是本专利技术的一个实施例中试剂盒的检测结果。图4是本专利技术的另一个实施例中试剂盒的检测结果。具体实施例方式本专利技术利用DNA扩增和“导流”反向点杂交技术来实现。首先，利用生物素标记的引物来扩增HPV基因组特异片段；然后，通过“导流”杂交方法，使生物素标记的扩增片段被特异性寡核苷酸探针杂交捕获，而后进行信号放大，以识别检测结果。实施例本专利技术提供一种检测高危型HPV的试剂盒及其检测方法，所述方法主要包括以下步骤:(a)提取样品的DNA ； (b)使用SEQ ID NO:1至4的引物对所提取的DNA进行PCR扩增；(c)利用导流杂交技术使用SEQ ID NO: 5和6的探针与PCR扩增的产物进行杂交；以及(d)通过显色反应识别是否发生杂交反应从而确定样品中是否存在HPV 16亚型和18亚型。以下以宫颈脱落细胞为例，具体说明本专利技术的方法。但应理解的是，本专利技术的试剂盒和方法仍可适用于其他临床样品。(I)样品/标本采集及保存 以无菌棉拭子或宫颈刷刷取患者的宫颈脱落细胞，以及用于活检的组织标本或疣组织，置于低温冰箱(_70°C或-20°C )保存。(II) DNA 提取 加入Iml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，吸取全部液体转至本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性检测样品中是否存在HPV16亚型或18亚型的试剂盒，?其特征在于：所述试剂盒包括：(i)?如SEQ?ID?NO:1和2所示的用于PCR扩增HPV16亚型DNA的第一引物对；(ii)?如SEQ?ID?NO:3和4所示的用于PCR扩增HPV18亚型DNA的第二引物对；以及(iii)?如SEQ?ID?NO:5和6所示的用于与PCR扩增产物杂交的一对探针或与SEQ?ID?NO:5和6所示的序列互补的序列的一对探针。

【技术特征摘要】
1.一种特异性检测样品中是否存在HPV16亚型或18亚型的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括:(i)如SEQ ID NO:1和2所示的用于PCR扩增HPV16亚型DNA的第一引物对；(ii)如SEQ ID N0:3和4所示的用于PCR扩增HPV18亚型DNA的第二引物对；以及(iii)如SEQ ID NO: 5和6所示的用于与PCR扩增产物杂交的一对探针或与SEQ ID NO: 5和6所示的序列互补的序列的一对探针。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包含(iv)如SEQID NO:7和8所示的用于PCR扩增人类β-球蛋白基因的片段的引物对；以及如SEQ ID NO: 9所示的用于与人类β_球蛋白扩增产物特异性结合的探针。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述引物均在5’端标记有生物素。4.根据权利要求2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾庆，张中满，张颖芬，罗晓兰，
申请(专利权)人：广州好芝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：