本发明专利技术提供一种疱疹类病毒EBV检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。使用本发明专利技术试剂盒中的核酸释放剂释放核酸的方法与煮沸法的检测结果没有明显差异，而本发明专利技术中提取核酸时采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取；本发明专利技术试剂盒检测EBV的灵敏度可达400copies/ml，定量线性范围为400~4.00E+09copies/ml；应用该试剂盒可以对血浆、咽拭子、外周血等未知样本中的EBV-DNA进行快速准确的检测，为诊断EBV感染提供可靠的实验依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供一种疱疫类病毒EB病毒(EBV)检测试剂盒，具体是一种基于突光PCR的EBV-DNA检测试剂盒。
技术介绍
EBV是一种普遍存在于人体的疱疹类病毒，人一旦感染后，就可能终身携带。EBV感染主要会引起儿童传染性单核细胞增多症及与许多肿瘤的发生有密切关系，严重威胁着人类特别是儿童的健康，因而一直倍受关注。临床上检测人体中EB病毒的存在对人体肿瘤的早期诊断有很大的价值。由于EBV分离培养困难，目前临床一般采用血清学方法和分子生物学方法辅助诊断。其中血清学方法主要是利用酶联免疫吸附试验或免疫荧光技术检测血清中特异性EBV抗体，但其检出率较低，且无法检测出潜伏的EB病毒。随着分子生物学的飞速发展，越来越多的分子生物学方法应用于检测EB病毒，其主要包括原位杂交技术，基因芯片技术和PCR技术等；随着FQ-PCR技术的发展，其在与EBV感染相关的人类肿瘤诊断领域的应用已越来越广泛，也越来越为人所重视，EB病毒感染的实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性。运用荧光PCR技术检测EB病毒DNA主要包括EB病毒核酸的提取和核酸的PCR扩增两方面。目前国内临床上主要采用直接煮沸法对血浆或血清样本中的EB病毒核酸进行提取，具体是向外周血单核细胞中加 入某种核酸裂解液，直接煮沸，高速离心，上清即为模板；该方法核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对高浓度的样本裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。国外临床上主要采用某种DNA提取试剂盒来提取EB病毒核酸，其提取效果较好，但是由于价格昂贵，难以在国内应用。临床上检测EBV-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定量检测。与传统的PCR相比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。目前国内外已有基于实时荧光定量PCR技术定量检测EBV-DNA的试剂盒应用于临床检测中，但这些试剂盒多半以煮沸法提取核酸，且其检测灵敏度不高，约在5000COpieS/ml左右。
技术实现思路
本专利技术提供一种核酸释放剂在疱疹类病毒EBV检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)O. θΓθ. 5mM/L，氯化钾2(T300mM/L，十二烷基磺酸钠O. 01 2%和乙醇O.05 1%。在本专利技术所述核酸释放剂中，其溶剂可以为本领域常用的，例如为无菌水或TE缓冲液。本专利技术首次披露在疱疹类病毒EBV检测中使用含强蛋白变性剂的核酸释放剂，在很大程度上简化了该病毒检测的步骤，而且检测灵敏度有了很大的提高。本专利技术提供一种疱疹类病毒EBV检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L，氯化钾2(T300mM/L，十二烷基磺酸钠O. Of 2%和乙醇O. 05^1% ;所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。使用本专利技术试剂盒中的核酸释放剂释放核酸的方法与煮沸法提取核酸的检测结果没有明显差异，而本专利技术中提取核酸时采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸， 无需加热即可完成DNA的释放和提取；本专利技术试剂盒检测EBV的灵敏度可达400copies/ml，定量线性范围为400 4. 00E+09copies/ml。具体的，用于靶多核苷酸的上游引物序列为5’ -TGCAGCTTTGACGATGGAGTAG-3’，下游引物序列为 5’ -TCACTCCTGCCCTTCCTCAC-3’，探针序列为 5’ -FAM-TTTGCCTCCCTGGTTTCCACCTATG-BHQ1-3’。需要说明的是，探针中FAM表示该探针羧基端使用FAM荧光基团标记，BHQl表示羟基端用BHQl淬灭基团修饰。本专利技术的试剂盒因采用用于检测靶多核苷酸的上述引物和/或探针序列，具有很好的特异性。在本专利技术中，优选的是，所述试剂盒中还包括用于将未知样本浓缩的EBV浓缩液，所述EBV浓缩液包括l(Tl00mM/L的聚乙二醇6000和5(T500mM/L的氯化钠溶液。在血浆、咽拭子或外周血等未知样本加入EBV浓缩液进行浓缩后，能更好地进行随后的EBV-DNA核酸释放和检测。本专利技术中，优选所述试剂盒中还包括内标，所述内标的序列为5’ -CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTC TGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’。本专利技术中所述内标为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，它作为PCR扩增体系中的阳性内对照，预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性。在所述试剂盒中包含内标的情况下，所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针；内标上游引物序列为5 ’ -CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3 ’，内标下游引物序列为 5’ -CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’，内标探针序列为 5’ -HEX-TTTGCTGAC TCACGTATTCGTAGCCAA - BHQl3’。同样的，探针中HEX表示其羧基端使用HEX荧光基团标记。优选本专利技术所述试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐热DNA聚合酶(Taq酶)和O. 5^2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同时在所述PCR反应液中还包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR产物，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用，从而防止样本检测假阳性。在一个具体实施方式中，所述试剂盒中还包括EBV定量参考品、EBV阳性对照和EBV阴性对照。本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核酸释放剂在疱疹类病毒EBV检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%。
【技术特征摘要】
1.一种核酸释放剂在疱疹类病毒EBV检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)O. θΓθ. 5mM/L，氯化钾 2(T300mM/L，十二烷基磺酸钠 O. 01 2% 和乙醇 O. 05 1%。2.一种疱疹类病毒EBV检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin) O. θΓθ. 5mM/L，氯化钾2(T300mM/L，十二烷基磺酸钠0. Of 2%和乙醇0. 05^1% ;所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的上游引物序列为 5’ -TGCAGCTTTGACGATGGAGTAG-3’，下游引物序列为 5’ -TCACTCCTGCCCTTCCT CAC-3’。4.根据权利要求2或3所述的检测试剂盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的探针序列为5’ -FAM-TTTGCCTCCCTGGTTTCCACCTATG-BHQ1-3’。5.根据权利要求2 4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括用于将未知样本浓缩的EBV浓缩液，所述EBV浓缩液包括l(Tl00mM/L的聚乙二醇6000和5(T500mM/L的氯化钠溶液。6.根据权利要求2 4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括内标，所述内标的序列为 5 ’ -CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTT TGCTG...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴立忠，邓中平，吴康，
申请(专利权)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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