筛查椰子死亡类病毒属类病毒的芯片及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种筛查椰子死亡类病毒属类病毒的芯片及其应用。本发明专利技术提供的鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒的探针，由9条探针组成，所述9条探针的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-9。还提供了筛查椰子死亡类病毒属类病毒的基因芯片，为将上述的探针固定在片基表面得到的基因芯片。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术采用生物信息学方法对椰子死亡类病毒属类病毒的核苷酸序列进行分析，设计了该组的兼容性探针，标准类病毒样品验证结果证明探针效果良好。本发明专利技术的筛查椰子死亡类病毒属类病毒的芯片可用于椰子死亡类病毒属类病毒的检疫鉴定。

Chip for screening coconut viroid viroid and its application

The invention discloses a chip for screening a genus of viruses belonging to the genus coconut and the use thereof. The invention provides a probe for identifying or assisting the identification of a genus of coconut dead virus viroid, consisting of 9 probes, wherein the nucleotide sequences of the 9 probes are sequentially sequence 1-9 in sequence table respectively. Also provides a gene chip screening cocadviroid virus, as the probe is fixed on the surface of the gene chip. The experiment proves that the nucleotide sequence of the invention, the use of biological information on cocadviroid virus methodology for analysis, design of the probe compatibility group, standard samples of the virus test showed that the probe has good effect. The invention is a chip for screening a genus of viruses belonging to the coconut dead virus, and can be used for quarantine and identification of the coconut dead viroid viroid.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物信息学及生物检疫鉴定
，尤其涉及筛查椰子死亡类病毒属类病毒的芯片及其应用。
技术介绍
椰子死亡类病毒属类病毒(CocadviiOid)属于马铃薯纺锤形块茎类病毒科(Pospiviroidae),根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy ofViruses, ICTV)第八次分类报告，该属包括柑橘类病毒IV (Citrus viroid IV，CVd-1 V)、挪子死亡类病毒(Coconut cadang-cadang viroid, CCCVd)、挪子败生类病毒(Coconut tinangaja viroid, CTiVd)及啤酒花潜隐类病毒(Hop latent viroid, HLVd)等 4 种类病毒。其中椰子死亡类病毒和椰子败生类病毒是2007年发布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中的检疫性有害生物。该属的类病毒可侵染椰子(Cocos nucifera)、油棕(Elaeis guineensis)、长柄贝叶掠(Corypha elata)，人工接种寄主有模榔(Areca catechu)、散尾葵(ChrysalidocaprusIutescens)、率椰(Phoenix dactylifera)、大王椰(Roystonea regia)、圣诞椰(Veitchiamerrillii)、甜澄(Citrus sinensis)和枸橡(Citrus medica)等多种重要的作物。椰子死亡类病毒是我国进境植物检疫性有害生物，也是国际上著名的检疫性有害生物，它严重危害椰子和油棕等棕榈科植物的生产，主要分布于菲律宾。1937年首次报道在菲律宾的椰子死亡病，病树根部坏死，顶芽枯死，底部叶脱落，花序短小、坏死；1976年确定该病病原体为椰子死亡类病毒。菲律宾从1914年发现椰子死亡病以来，约有3亿株椰子树死亡，据估算每株感病椰子的经济损失约为80 100美元。菲律宾每年约有50万株病树枯死，仅1986年由新出现的病树引起的直接经济损失达2000万美元以上。椰子是我国热带主要果树之一，具有很高经济价值，在热带作物种植业中占据重要地位。海南岛是我国椰子分布最集中的地方，是我国椰子的主产区，全省椰子种植面积达到68万亩，年产椰子2. 26亿个，产量占全国的99%。此外，椰子在粤西的雷州半岛和西双版纳以及西沙群岛也都有少量栽培。观赏棕榈植物种植是当前农业开发的热点，不断从国外引进棕榈科观赏植物新品种，椰子类病毒传入我国的可能性加大。因此，建立该属类病毒的筛查方法，对防止该属类病毒传入我国，保护我国棕榈科植物的生产和环境、旅游资源，具有重要经济意义。由于本属具有潜在新发检疫性类病毒的可能，而目前用于该属类病毒检测的方法如指示植物法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、核酸斑点杂交技术及分子生物学技术等只能对该属已知类病毒进行特异性检测，对于未知及新发的类病毒监测无能为力，所以容易造成危险性类病毒漏检并传播扩散，进而导致巨大的经济损失和不良的社会影响。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒的探针组。本专利技术提供的鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒的探针组，由探针I-探针9共9条探针组成，所述探针I-探针9的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-9。上述探针中，所述椰子死亡类病毒属类病毒为柑橘类病毒IV、椰子死亡类病毒、椰子败生类病毒或啤酒花潜隐类病毒。本专利技术的另一个目的是提供一种筛查椰子死亡类病毒属类病毒的基因芯片。本专利技术提供的筛查椰子死亡类病毒属类病毒的基因芯片，为将上述的探针固定在片基表面得到的基因芯片。在上述基因芯片中，所述片基为醛基化玻璃片基，在本专利技术的实施例中采用的是博奥生物有限公司晶芯 微阵列基片，产品目录号420022。 在上述基因芯片中，所述椰子死亡类病毒属类病毒为柑橘类病毒IV、椰子死亡类病毒、椰子败生类病毒或啤酒花潜隐类病毒。本专利技术的第三个目的是提供一种筛查椰子死亡类病毒属类病毒的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括上述的基因芯片。上述试剂盒还包括用于扩增所述椰子死亡类病毒属类病毒的cDNA的引物对，所述引物对具体由序列表中序列10和序列表中序列11所示的DNA分子组成；所述椰子死亡类病毒属类病毒为啤酒花潜隐类病毒。上述探针组、上述基因芯片或上述试剂盒在如下1)-4)中的应用，也是本专利技术保护的范围I)鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒；2)制备鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒产品；3)鉴定或辅助鉴定待测植物感染椰子死亡类病毒属类病毒；4)制备鉴定或辅助鉴定待测植物感染椰子死亡类病毒属类病毒产品。上述应用中，所述待测植物为椰子、柑橘或啤酒花；所述椰子死亡类病毒属类病毒为柑橘类病毒IV、椰子死亡类病毒、椰子败生类病毒或啤酒花潜隐类病毒。本专利技术的第四个目的是提供一种筛查或辅助筛查待测植物感染椰子死亡类病毒属类病毒的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤I)将待测植物的组织的cDNA进行标记，得到标记后产物；2)将步骤I)得到的标记后产物与上述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片；3)将步骤2)得到的杂交后芯片扫描，若所述基因芯片上的至少一条所述探针的信号绝对值不小于600且信噪比不小于3. 0，则待测植物感染或候选感染椰子死亡类病毒属类病毒。上述方法中，步骤I)中，所述标记为以所述cDNA为模板，以上述的试剂盒中的任一所述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物，再将所述PCR产物进行Klenow酶标记，得到标记后产物；步骤2)中，所述杂交的温度为42°C，所述杂交的时间为12h ；在所述步骤2)后和步骤3)前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤；所述至少一条所述探针为所述探针组中的任意一条；所述待测植物为啤酒花，所述组织为叶片；所述椰子死亡类病毒属类病毒为啤酒花潜隐类病毒。本专利技术的实验证明，本专利技术提供的筛查椰子死亡类病毒属类病毒芯片中的探针具有椰子死亡类病毒属类病毒属水平上的高兼容性和属内的特异性，所需的样品量少，一般仅需O. lg。另外数据的分析与计算机图像处理软件相结合，达到分析结果能够直观化、可视化。本专利技术采用生物信息学方法对椰子死亡类病毒属类病毒的核苷酸序列进行分析，设计了该属的兼容性探针，标准类病毒样品验证结果证明探针效果良好。本专利技术的椰子死亡类病毒属类病毒筛查芯片可用于椰子死亡类病毒属类病毒的检疫鉴定。附图说明图I为椰子死亡类病毒属类病毒筛查芯片探针点阵示意图(6X7) 图2为应用啤酒花潜隐类病毒样品验证属筛查芯片的特异性图3为应用啤酒花潜隐类病毒样品验证属筛查芯片的灵敏度检测结果图4为PCR灵敏度检测结果具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、筛查椰子死亡类病毒属类病毒的芯片的制备I、属级高兼容性寡核苷酸探针的设计从美国国立生物技术信息中心(NCBI)及国际病毒学分类委员会(ICTV)数据库下载类病毒属全基因组及核酸序列；去除90%以上长度与其它序列有95%相似度的核酸序列；以5个碱基作为间隔，连续提取所有40mer的核酸序列；以40% ( GC含量< 60%、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒的探针组，由探针I-探针9共9条探针组成，所述探针I-探针9的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-9。2.根据权利要求I所述的探针组，其特征在于所述椰子死亡类病毒属类病毒为柑橘类病毒IV、椰子死亡类病毒、椰子败生类病毒或啤酒花潜隐类病毒。3.—种筛查椰子死亡类病毒属类病毒的基因芯片，为将权利要求I或2所述的探针组固定在片基表面得到的基因芯片。4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述片基为醛基化玻璃片基；所述椰子死亡类病毒属类病毒为柑橘类病毒IV、椰子死亡类病毒、椰子败生类病毒或啤酒花潜隐类病毒。5.一种筛查椰子死亡类病毒属类病毒的试剂盒，包括权利要求3或4所述的基因芯片。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括用于扩增所述椰子 死亡类病毒属类病毒的cDNA的引物对，所述引物对具体由序列表中序列10和序列表中序列11所示的DNA分子组成；所述椰子死亡类病毒属类病毒为啤酒花潜隐类病毒。7.权利要求I或2所述探针组、权利要求3或4所述的基因芯片、权利要求5或6所述的试剂盒 在如下I)-4)中的应用，也是本发明保护的范围 O鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒； 2)制备鉴定或辅助鉴定椰子死亡类病毒属类病毒产品； 3)鉴定或辅助鉴定待测植物感染椰子死亡类病...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永江，李明福，李桂芬，李世访，朱水芳，辛言言，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：