一种香蕉炭疽病菌分子检测引物及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种香蕉炭疽病菌分子检测引物及其检测方法，属于农作物病害检测和生物技术领域。该特异性引物包括上游引物BCMF：5’‑ATAACTGTTGCTTCGGCGGG‑3’，下游引物BCMR：5’‑CCCAGTGCGAGACGTAAAGT‑3’。所发明专利技术的检测引物及检测方法可用于香蕉炭疽病菌纯培养的检测鉴定，也能对香蕉叶片和果实进行检测；本发明专利技术检测引物特异性强、灵敏度高，检测方法实用性好，操作简便快捷；本发明专利技术能实现香蕉炭疽病潜伏侵染期的检测，还能有效区分香蕉上相似的黑星病、叶斑病，对香蕉炭疽病的早期预警和防控，防治病害的扩散蔓延具有重要意义。

Molecular detection primer for banana anthracnose pathogen and detection method

The invention relates to a molecular detection primer of a banana anthracnose pathogen and a detection method thereof, belonging to the field of crop disease detection and biotechnology. The specific primers including upstream primer BCMF:5 ATAACTGTTGCTTCGGCGGG '3', 'CCCAGTGCGAGACGTAAAGT primer BCMR:5 3. \. The primers were invented and detection methods can be used for the detection and identification of banana anthracnose in pure culture, but also can detect the banana leaf and fruit; the detection primers with strong specificity and high sensitivity detection method, good practicability, convenient operation; the invention can realize the detection of banana anthracnose latent infection period, but also to distinguish similar banana scab, leaf spot disease, early warning and prevention and control of banana anthracnose, disease prevention and control of the spread of diffusion has important significance.

【技术实现步骤摘要】
一种香蕉炭疽病菌分子检测引物及检测方法
本专利技术涉及一种香蕉炭疽病菌分子检测引物及其检测方法，专用于香蕉炭疽病菌的快速分子检测，同时可实现田间香蕉炭疽病菌的潜伏侵染期的诊断和病菌的监测鉴定，属于农作物病害检测和生物

技术介绍
香蕉是世界著名的热带、亚热带水果，其特点是:高热量、低脂肪，富含人体所必须的碳水化合物、蛋白质、矿物质等，其中K的含量为水果之最。世界上有50多个国家生产香蕉，年产销量达4千多万吨，中国年产量在150-190万吨。香蕉炭疽病(Anthracnose)是一种严重的世界性病害，由芭蕉炭疽菌(Colletotrichmmusae)侵染引起，可为害香蕉植株的地上各部位，以为害果实最重要，叶片上病斑长椭圆形或不规则形，大小不等，边缘褐色稍深，分生孢子盘为黑色小粒状，香蕉生长后期小黑点布满叶片；为害青果时，病斑长椭圆形，黑褐色，上生许多小黑点，为害成熟果实时，黑褐色，有时有圆心轮纹，常中央纵列；为害果柄常引起落果。果实一旦发病，扩展迅速，表现为果皮褐变，果肉逐渐腐烂，严重影响果品价值，不数日便全果烂掉，我国香蕉采后病害以炭疽病发生最普遍，给生产、贮运及销售造成巨大经济损失，严重影响着我国香蕉的北运和出口。香蕉炭疽病菌侵染香蕉果实有一个重要的特性，即潜伏侵染特性，目前以症状为基础的病害常规诊断技术，需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析等步骤，耗时长、效率低、准确性差，难以做到病害发生时及时检测和有效控制病原菌的传播和病害流行，而香蕉炭疽菌潜伏侵染特性使得人们无法通过症状来诊断香蕉果实是否染病及染病的程度，迫切需要一种快速、准确的分子检测方法。近年来，分子生物学技术发展迅速，随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，分子生物技术的应用使重要病原真菌的检测、诊断与鉴定上升到新的水平，而实际应用层面及辅助分类鉴定诊断与检测为植物病理学做出了重要贡献。其中PCR（polymerasechainreaction）技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断。真菌核糖体转录间隔区（internaltranscribedspacer,ITS）序列种内的保守性和科属种间可变性的特点，设计特异性引物进行PCR，对病原菌进行快速检测和鉴定的技术已受到广泛的应用，国内外研究人员已成功开发出大豆疫霉、辣椒疫霉、柑橘溃疡病菌、甘薯黑斑病菌和玉米南方锈病菌等多种病原菌的特异性引物和检测方法，实现了快速、灵敏和准确的鉴定。但目前有关香蕉炭疽病菌快速分子检测的研究尚未见报道。
技术实现思路
针对现有技术中对香蕉炭疽病的检测主要基于症状特征，香蕉炭疽病菌鉴定主要基于病原形态学特征，程序繁琐、耗死长、对鉴定经验要求高、准确度低，难以诊断具有潜伏侵染特性的香蕉炭疽病的问题，提供了一种香蕉炭疽病菌分子检测引物及其检测方法。为实现上述目的，本专利技术采取了以下技术方案：本专利技术首先提供了一种香蕉炭疽病菌分子检测引物，其核苷酸序列为：上游引物BCMF：5’-ATAACTGTTGCTTCGGCGGG-3’；下游引物BCMR：5’-CCCAGTGCGAGACGTAAAGT-3’。所述引物BCMF和BCMR对香蕉炭疽病菌特异性扩增出406bp的产物。本专利技术还提供了一种香蕉炭疽病菌的快速检测方法，包括以下步骤：(1)从香蕉叶片或香蕉果皮中提取DNA；用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA；用于检测香蕉植株组织是否存在香蕉炭疽病菌时，采用NaOH快速裂解法提取香蕉植株组织基因组DNA；(2)以提取香蕉叶片或香蕉果皮DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BCMF和BCMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸40sec，共35个循环；72℃延伸10min；(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出406bp的产物，则可判定所述的香蕉叶片或香蕉果皮中存在香蕉炭疽病菌，否则所述的香蕉叶片或香蕉果皮中不存在香蕉炭疽病菌。本专利技术的积极有益效果在于：（1）准确性高：本专利技术是根据真菌核糖体转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对香蕉炭疽病菌具有特异扩增作用的PCR引物。已经对不同地理来源的香蕉炭疽病菌、携带香蕉炭疽病菌的叶片、携带香蕉炭疽病菌的果实和健康的香蕉组织进行了检测验证，只有香蕉炭疽病菌和携带该病菌的组织中能特异性地扩增出一条406bp的电泳条带，说明本专利技术所设计的引物用于检测香蕉炭疽病菌准确可靠；（2）特异性强：本专利技术所设计的引物对香蕉炭疽病菌具有很强的特异性，能够用于区别香蕉炭疽病菌(Colletotrichmmusae)、香蕉焦腐病菌(Botryodiplodiatheobromae)、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorporaoryzae)、轮枝菌冠腐病菌(Verticilliumtheobromae)、香蕉酸腐病菌(Geotrichumcandidum)、香蕉黑星病菌(Phyllostictamusarum)等香蕉上常见的病原菌，从而能有效区分发生在香蕉上症状特征相似的病害；（3）灵敏度高：本专利技术将设计的特异引物与ITS基因通用引物（ITS1/ITS4）联合起来进行巢式PCR扩增后，对香蕉炭疽病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到1fg；（4）适用性广、实用性好：本专利技术的香蕉炭疽病菌的检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的香蕉组织进行检测，可实现香蕉炭疽病菌的潜伏侵染期检测，即在病害显症前进行检测，防治采后香蕉炭疽病的爆发流行。（5）、操作简便快速：本专利技术只需进行DNA提取、PCR扩增和琼脂糖电泳后即可判定结果，一般整个检测过程可在数小时内完成，操作简便快捷。附图说明图1为本专利技术引物对香蕉炭疽病菌特异性扩增电泳图：其中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道2、泳道3为香蕉炭疽病菌，泳道4-10分别为：香蕉焦腐病菌(Botryodiplodiatheobromae)、香蕉黑孢冠腐病菌(Nigrorporaoryzae)、轮枝菌冠腐病菌(Verticilliumtheobromae)、香蕉酸腐病菌(Geotrichumcandidum)、香蕉黑星病菌(Phyllostictamusarum)、轮枝菌冠腐病菌(Verticilliumtheobromae)阴性对照。图2为本专利技术引物香蕉炭疽病菌的灵敏性检测扩增电泳图：A：普通PCR灵敏度检测，其中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道2-12分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、阴性对照、阳性对照；B为巢式PCR灵敏度检测，其中泳道M为2000本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种香蕉炭疽病菌分子检测引物，其特征在于：引物的核苷酸序列为：上游引物BCMF：5’‑ATAACTGTTGCTTCGGCGGG‑3’下游引物BCMR：5’‑CCCAGTGCGAGACGTAAAGT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种香蕉炭疽病菌分子检测引物，其特征在于：引物的核苷酸序列为：上游引物BCMF：5’-ATAACTGTTGCTTCGGCGGG-3’下游引物BCMR：5’-CCCAGTGCGAGACGTAAAGT-3’。2.根据权利要求1所述香蕉炭疽病菌分子检测引物，其特征在于，所述上游引物BCMF和下游引物BCMR对香蕉炭疽病菌特异性扩增出406bp的产物。3.一种香蕉炭疽病菌的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)提取香蕉叶片或香蕉果皮的DNA；(2)以提取的香蕉叶片或香蕉果皮DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的...

【专利技术属性】
技术研发人员：石妞妞，杜宜新，陈福如，阮宏椿，代玉立，杨秀娟，甘林，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35