一种无乳链球菌的检测引物组、检测试剂盒和多重PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种无乳链球菌的检测引物组，包括引物对hylB、引物对ponA和引物对cfb；其中，所述引物对hylB 包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物hylB‑F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物hylB‑R；所述引物对ponA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物ponA‑F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物ponA‑R；所述引物对cfb包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物cfb‑F和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物cfb‑R。本发明专利技术还公开了包含所述引物组的检测试剂盒和使用所述检测试剂盒的多重PCR检测方法本发明专利技术特异性好、灵敏度高、简单快速、高效精准，适用于无公害水产品中无乳链球菌的快速检验检疫，可直接应用于水产养殖病害的早期监测和预警。检测无乳链球菌DNA的最低浓度为7.74×10‑3 ng/ uL，不需经过细菌培养，检测所需样品量少，可实现微创取样。

Detection primer set, detection kit and multiplex PCR detection method for Streptococcus lactis

The invention discloses a primer set for detection of Streptococcus agalactiae, including primer hylB, primer ponA and primer CFB; wherein, the primers of hylB including the nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 shown primer hylB nucleotide sequence of SEQ F and ID NO.2 shown primer hylB R; the primers of ponA including nucleotide sequence of SEQ ID NO.3 shown primer ponA nucleotide sequence of SEQ F and ID NO.4 shown primer ponA R; the CFB primers including nucleotide sequence of SEQ ID NO.5 shown F and primer CFB nucleotide sequence of SEQ ID NO.6 shown R primer cfb. The invention also discloses a detection kit containing the primer set and use the multiple PCR detection kit test of the invention has good specificity, high sensitivity, simple and rapid, efficient and accurate, suitable for rapid inspection and quarantine in pollution-free aquatic products in Streptococcus agalactiae, early detection and early warning can be directly applied to aquaculture disease. The lowest detection concentration of Streptococcus agalactiae DNA 7.74 * 10 ng/ uL 3, without bacterial culture, detection of small quantity of sample, can achieve minimally invasive sampling.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于水产养殖动物病原菌检测领域，具体涉及一种无乳链球菌的检测引物组。同时本专利技术还涉及了包含上述引物组的检测试剂盒以及使用所述试剂盒的多重PCR检测方法。
技术介绍
无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)隶属于芽孢杆菌纲，乳杆菌目，链球菌科，链球菌属，为兼性革兰氏阳性球菌，是养殖鱼类的重要病原菌之一，无乳链球菌还能感染人、哺乳动物，是重要的人兽鱼共患病原菌。至今为止，发现有30多种养殖淡水鱼类和50多种海水鱼类容易受到无乳链球菌的感染，世界水产业每年因无乳链球菌病造成的损失均高达100亿美元，其中以罗非鱼最易受到该病菌的入侵。无乳链球菌病发病较快，除一部分急性死亡外，并没有明显的症状，因此从发病鱼的症状上很难判断病原菌的种类，从而对疾病的有效处理产生影响。因此，在水产养殖生产中建立对无乳链球菌的快速检测技术，是有效预防链球菌病的重要手段，也为提高水产品质量安全提供保障。目前，关于无乳链球菌检测主要依靠病原菌的分离和生理生化鉴定等方法，这些方法操作繁琐、检测周期长，不能达到快速鉴定的目的。分子鉴定具有快速、简便以及灵敏度高的优点，是微生物鉴定的发展趋势。虽然有关无乳链球菌的分子检测方法国内外已有报道，但多数是利用纯培养的菌液进行检测，使用普通PCR方法，一次只能检测一个基因，常常会造成漏检或误检。多重PCR是在一次反应中能同时扩增多个目的片段的靶序列，该技术可用于多种病原微生物的检测或鉴定，在同一PCR反应管中同时加多对特异性引物，进行PCR扩增，其最大的问题在于引物的设计和反应条件的优化，因为各种引物混合后扩增会有条带丢失现象，各引物间还存在竞争关系，强势引物可能掩盖弱势引物，导致目的片段丢失，甚至引物间相互作用会产生严重的引物二聚体。目前有构建无乳链球菌三重PCR检测方法的文献报道，但该检测技术对无乳链球菌DNA样本的最低检测浓度仅为3.2×10-1ng/μL。有鉴于此，开发一种快速、高效、特异性好、灵敏度高的无乳链球菌多重PCR势在必行，这对于加强水产品养殖水体、水产品中无乳链球菌的快速检验检疫、水产养殖病害的早期监测和预警、无公害水产品检测和生产，以及水产品卫生质量监督检验等方面具有重要的意义。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术的目的之一是提供一种检测无乳链球菌的检测引物组，该引物组对无乳链球菌的特异性好、灵敏度高。编码无乳链球菌透明质酸裂解酶的hylB基因、青霉素结合蛋白ponA基因和成孔毒素特性CAMP因子的cfb基因是真正与致病相关的无乳链球毒力基因，以它们为靶标设计引物，可以提高检测的特异性和灵敏度。故，本专利技术的第一个目的通过以下技术方案来实现：一种无乳链球菌的检测引物组，包括引物对hylB、引物对ponA和引物对cfb；其中，所述引物对hylB包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的引物hylB-F和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的引物hylB-R；所述引物对ponA包括核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的引物ponA-F和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的引物ponA-R；所述引物对cfb包括核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的引物cfb-F和核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的引物cfb-R。本专利技术目的之二是提供含有上述的无乳链球菌检测引物组的试剂盒。进一步地，所述的无乳链球菌的检测试剂盒，还包含TE缓冲液、溶菌酶、蛋白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-异戊醇混合溶液、异丙醇、体积浓度为70%的乙醇、CTAB的NaCl溶液、阳性对照品和PCRDsMix。进一步地，上述的无乳链球菌的检测试剂盒，所述酚-氯仿-异戊醇混合溶液中酚、氯仿和异戊醇的体积比为26~24:23.2~24.8:0.8~1.2。进一步地，上述的无乳链球菌的检测试剂盒，所述CTAB的NaCl溶液为将CTAB溶于0.5mol/L的NaCl溶液中，CTAB和所述NaCl溶液的质量体积比为0.8~1.2:20.2~19.8。进一步地，上述的无乳链球菌的检测试剂盒，所述阳性对照品为无乳链球菌的DNA模板。进一步地，上述无乳链球菌的检测试剂盒，所述检测引物组中的引物浓度均为10μM。本专利技术目的之三是提供使用上述试剂盒检测无乳链球菌的多重PCR检测方法。使用上述试剂盒检测无乳链球菌的多重PCR检测方法，包括如下步骤：1）取待检测样品50~100mg并加入1000μL的TE缓冲液，用匀浆器充分匀浆，取组织匀浆液180μL，转入到1.5ml的离心管中，加入20μL浓度为50mg/mL的溶菌酶，30℃孵育10min；2）向步骤1）溶液中加入10μL质量浓度为10%SDS和5μL20mg/mL的蛋白酶K，并于37℃温育1h；3）向步骤2）温育后的溶液中加入50μL5mol/L的NaCl溶液,充分混匀后再加入40μLCTAB的NaCl溶液，65℃温育20min；4）向步骤3）温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶液混匀，12000g/min离心4-5min；5）将步骤4）离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0.6-0.8倍体积的异丙醇，12000g/min离心4-5min；6）去上清，沉淀用1mL的体积浓度为70%的乙醇洗涤后，12000g/min离心4-5min；7）步骤6）离心后去上清，沉淀常温干燥5-10min，重溶于30-50μLTE缓冲液，即为样品DNA模板；8）配制样品组多重PCR反应体系包括：12.5μL2×PCRDsMix、0.5μL引物hylB-F、0.5μL引物hylB-R、0.6μL引物ponA-F、0.6μL引物ponA-R、0.5μL引物cfb-F、0.5μL引物cfb-R、1.0μL步骤7）得到的样品DNA模板和8.3μL无菌水；9）配制阳性对照组多重PCR反应体系包括：12.5μL2×PCRDsMix、0.5μL引物hylB-F、0.5μL引物hylB-R、0.6μL引物ponA-F、0.6μL引物ponA-R、0.5μL引物cfb-F、0.5μL引物cfb-R、1.0μL阳性对照品和8.3μL无菌水；10）将步骤8）制得的样品组和步骤9）制得的阳性对照组多重PCR反应体系分别混匀后12000g/min离心10s，置于PCR仪中，分别于94℃预变性4min，94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min，进行PCR反应；11）对步骤10）PCR反应结果进行电泳检测，并于凝胶成像系统下观察结果，若样品孔电泳条带出现与阳性对照孔相同大小的条带，则说明待测样品中含有无乳链球菌。所述步骤(11)电泳检测中，分别设置样品孔、阳性对照孔和参比孔；所述样品孔取步骤10）样品组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合，加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中；所述阳性对照孔取步骤10）阳性对照组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合，加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中；所述参比孔取5μLDL2000DNAMarker加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中；以120V电压分别对所述样品孔、所述阳性对照孔和所述参比孔进行电泳25min。本专利技术上述检测方法可用于检测包括动物体、水产品、养殖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无乳链球菌的检测引物组，其特征在于，包括引物对hylB、引物对ponA和引物对cfb；其中，所述引物对hylB 包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物hylB‑F和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物hylB‑R；所述引物对ponA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物ponA‑F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物ponA‑R；所述引物对cfb包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物cfb‑F和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物cfb‑R。

【技术特征摘要】
1.一种无乳链球菌的检测引物组，其特征在于，包括引物对hylB、引物对ponA和引物对cfb；其中，所述引物对hylB包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的引物hylB-F和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的引物hylB-R；所述引物对ponA包括核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的引物ponA-F和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的引物ponA-R；所述引物对cfb包括核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的引物cfb-F和核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的引物cfb-R。2.包含权利要求1所述检测引物组的无乳链球菌检测试剂盒。3.根据权利要求2所述的无乳链球菌检测试剂盒，其特征在于，还包括TE缓冲液、溶菌酶、蛋白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-异戊醇混合溶液、异丙醇、体积浓度为70%的乙醇、CTAB的NaCl溶液、阳性对照品和PCRDsMix。4.根据权利要求3所述的无乳链球菌检测试剂盒，其特征在于，所述酚-氯仿-异戊醇混合溶液中酚、氯仿和异戊醇的体积比为26~24:23.2~24.8:0.8~1.2。5.根据权利要求3所述的无乳链球菌检测试剂盒，其特征在于，所述CTAB的NaCl溶液为将CTAB溶于0.5mol/L的NaCl溶液中，CTAB和所述NaCl溶液的质量体积比为0.8~1.2:20.2~19.8。6.根据权利要求3所述的无乳链球菌检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为无乳链球菌的DNA模板。7.根据权利要求2所述无乳链球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测引物组中的引物浓度均为10μM。8.采用权利要求3~7任一所述检测试剂盒进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）取待检测样品50~100mg并加入1000μL的TE缓冲液，用匀浆器充分匀浆，取组织匀浆液180μL，转入到1.5ml的离心管中，加入20μL浓度为50mg/mL的溶菌酶，30℃孵育10min；2）向步骤1）溶液中加入10μL质量浓度为10%SDS和5μL20mg/mL的蛋白酶K，并于37℃温育1h；3）向步骤2）温育后的溶液中加入50μL5mol/L的NaCl溶液,充分混匀后再加入40μLCTAB的NaCl溶液，65℃温育20min；4）向步骤3）温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏友禄，刘婵，冯娟，郭志勋，王江勇，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44