一种定位引起酵母特殊生长表型的序列位置的方法技术

本发明专利技术涉及功能基因组学技术领域，公开了一种定位引起酵母特殊生长表型的序列位置的方法。本发明专利技术所述方法利用全合成酵母或半合成酵母与野生型酵母在功能基因上的序列差异，采用合成型扩增引物和野生型扩增引物，分别对特殊生长表型和正常生长表型的酵母进行PCR，根据结果分别锁定正常生长表型酵母DNA和特殊生长表型酵母DNA采用扩增引物扩增后无法扩增出条带的功能基因位置，从而快速确定两者重叠的功能基因位置即为引起酵母特殊生长表型的序列位置，避免了耗时耗力的单独菌株的基因型验证过程。

A method for locating sequence positions that cause yeast specific growth phenotypes

The present invention relates to the technical field of functional genomics, and discloses a method for positioning sequence positions that cause yeast specific growth phenotypes. The sequence difference of the method of the invention is the use of synthetic or semi synthetic yeast yeast and yeast in wild type genes, using synthetic primers and wild type primers, respectively for the special growth phenotype and normal growth phenotypes of yeast PCR, according to the results of normal growth phenotypes were locked yeast DNA and special growth phenotype of yeast using DNA primers to amplified gene amplification bands with the function position, can quickly determine the position of the two genes overlap is caused by yeast specific growth phenotype sequence position, to avoid the genotype alone strain time-consuming verification process.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及功能基因组学
，具体涉及一种定位引起酵母特殊生长表型的序列位置的方法。
技术介绍
随着DNA测序技术的普及，越来越多物种的全基因组信息被揭示，此外，转录组、蛋白质组、代谢组等相关组学技术的发展使得科学家们对生物细胞内各种复杂的代谢通路以及精细的调控机制有了更深刻的认知。最近几年，DNA合成成本的不断降低和大片段DNA组装技术的不断更新，使得人们可以利用合成生物学方法实现大尺度DNA的理性设计或者再造，从而达到微生物细胞的特性优化或以微生物作为细胞工厂实现化学品的规模生产。例如构建合成流感疫苗病毒以快速应对流感、多基因的遗传通路、细胞器基因组、噬菌体基因组、细菌基因组、酵母基因组甚至多细胞生物基因组。合成基因组学的发展把合成生物学带入了全新的阶段，我们可以对全基因组序列进行设计、合成和重排，建立全新的生物运行体系。其应用前景是不可估量的，合成基因组技术在改变人类生产生活的方式中具有巨大的潜力，例如把二氧化碳或生物质转化为高价值的产品，如食物、生物燃料、生物材料或生物医药。酵母是合成生物学研究的重要模式生物，也是作为细胞工厂生产高价值产品的重要底盘细胞，但野生型酵母相关性状的获得需要耗时耗力低效率的随机突变筛选过程，或者需要进行长时间的理论摸索从而进行理性改造。合成型酵母是目前较为前沿的研究领域，其根据野生型酵母菌株的基因组信息，在野生型酵母功能基因的相应位置，采用人工合成的具有特异性标签的能够表达出相同蛋白的序列进行替换。通俗的讲，合成型酵母与野生型酵母的区别仅是对应的功能基因序列不同，但均能够表达出相同的功能蛋白。整个基因组全部采用人工合成序列的合成型酵母称为全合成型酵母，而整个基因组中部分采用人工合成序列的合成型酵母称为半合成型酵母。采用合成型酵母的优势在于，其比野生型酵母基因组结构更加稳定，同时因为在构建合成型酵母时可以增加一些便于后续试验所需要的“插件”，所以增加了合成型酵母基因组的灵活性，利于酵母基因组的快速重排和人工改造。利用合成型酵母能够快速优化酵母底盘细胞，得到相关性状(耐受性、化学品产率)提升的酵母菌株，这是野生型酵母无法具备的优势。化学合成全新的物种基因组或者构建人工的生物系统需要科学家对每一个生物学细节都有深刻的理解，然而生物体并不是元件或模块的简单拼接。由于生命运作规律的复杂性以及人类认知的局限性，理性设计改造的基因组中往往会非主观的引入一些引起细胞生长缺陷的改变。合成型酵母同样不例外，虽然从开始就极力避免一些能够影响酵母菌株生长性状的序列的导入，但是生物体是一种精细的系统，人工设计的序列存在一定的意外，表现在宏观层面就是合成型酵母出现异于野生型酵母的生长性状，而这些特殊生长表型一般都是对实际培养或生产不利的，例如在30℃的YPGE培养基上长势变差等。而此时，对引起细胞生长缺陷的合成型序列的定位会随着合成基因组规模的扩大成为一件耗时耗力的工作。同样地，某些野生型酵母也会存在一些对实际培养或生产不利的特殊生长表型，而其相对的全合成酵母或半合成酵母就消除了这种特殊生长表型，对规模较大的野生型酵母基因组来说，对引起细胞生长缺陷的序列的定位同样是一件繁琐的工作。酵母是一个可以发生高效的同源重组的生物体，传统的对酵母细胞功能基因组研究的方式是利用酵母细胞减数分裂时非姐妹染色单体之间的信息交换，实现对引起生长缺陷靶点的定位。这个过程需要利用酵母显微操作仪进行大量四分体的拆分，以及对成千上万的单个孢子进行逐一基因型验证，是一个耗时耗力的过程。因此，需要一种可以高效的对产生合成型酵母菌特殊生长表型的序列位置定位的方法来解决目前的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种定位引起酵母特殊生长表型的序列位置的方法，使得所述方法能够更加简便和快速。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种定位引起全合成酵母或半合成酵母特殊生长表型的序列位置的方法，包括：步骤1、将具有特殊生长表型的全合成酵母或半合成酵母与正常生长表型的野生型酵母交配形成二倍体酵母菌株(也称为回交)，然后进行生孢培养使所述二倍体酵母菌株发生减数分裂，收集所有孢子，获得杂合单倍体孢子库；或合成型染色体片段替换正常生长表型的酵母野生型染色体获得的具有特殊生长表型的半合成酵母，通过收集替换过程中因同源重组产生的所有转化子，获得杂合单倍体转化子库；步骤2、根据正常生长表型和特殊生长表型设置选择性培养条件，将杂合单倍体孢子库或杂合单倍体转化子库分为正常表型库和特殊表型库；步骤3、分别提取正常表型库和特殊表型库中所有菌株的DNA，然后设计全合成酵母或半合成酵母每个功能基因的扩增引物，称为合成型扩增引物，设计野生型酵母每个功能基因的扩增引物，称为野生型扩增引物，以本步骤所述DNA为模板分别进行混合菌落PCR扩增；步骤4、记录正常生长表型的菌株库DNA采用合成型扩增引物扩增后无法扩增出条带的功能基因位置，以及特殊生长表型的菌株库DNA采用野生型扩增引物扩增后无法扩增出条带的功能基因位置，两者重叠的功能基因位置即为引起全合成酵母或半合成酵母特殊生长表型的序列位置。由于现有的定位过程需要进行大量四分体的拆分以及单个孢子(单倍体菌株)的基因型验证，这中工作量是极其庞大、繁琐的。针对这个问题，本专利技术提出上述高效的定位方法。本专利技术所述全合成酵母为含有完整合成型染色体的酵母，所述半合成酵母为含有部分合成型染色体和部分野生型染色体的酵母。为了便于理解本专利技术的技术思路，在图1所示的方法流程图的基础上对本专利技术方法的原理进行阐述：具有特殊生长表型的全合成酵母或半合成酵母与野生型酵母交配形成二倍体后进行减数分裂，在减数分裂时酵母染色体之间会发生不同情形的链交换，这就使最终的单倍体孢子成为即包含合成型染色体又包含野生型染色体的杂合单倍体孢子，并且具有多种情形，所有的杂合单倍体孢子就形成了一个库，在这个库中存在特殊生长表型和正常生长表型两类菌，将其分成正常表型库和特殊表型库。全合成酵母或半合成酵母与野生型酵母在功能基因序列上存在差别，针对这个差别本专利技术设计每个功能基因的扩增引物，每个合成型功能基因的引物共同组成合成型扩增引物，而每个野生型功能基因的引物共同组成野生型扩增引物。合成型扩增引物只能扩增出合成型功能基因的条带，而野生型扩增引物只能扩增出野生型功能基因的条带，借助这种特异性，本专利技术用合成型扩增引物和野生型扩增引物以正常表型库/特殊表型库的所有菌落DNA为模板，分别进行PCR，由于是正常表型，那么引起特殊表型的序列在链交换时都被替换成了野生型染色体，而合成型扩增引物无法扩增出这个位置的序列条带，但链交换的形式是多种多样的，肯定存在其他位置的序列也被野生型染色体替换，仅依靠正常表型菌的扩增结果无法准确定位，还需要借助特殊表型菌的扩增结果。由于是特殊表型，那么引起特殊表型的序列在链交换时都被替换成了合成型染色体，而野生型扩增引物无法扩增出这个位置的序列条带，两种结果进行重叠，就可以排除正常表型菌中其他位置的序列也被野生型染色体替换无法扩增出条带的情形，直接定位出引起特殊表型的序列位置。在半合成酵母的分类中，包括构建全合成酵母过程中产生的酵母、全合成酵母和野生型酵母发生链交换产生的酵母或合成型染色体片段替换酵母野生型染色体产生的酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定位引起全合成酵母或半合成酵母特殊生长表型的序列位置的方法，其特征在于，包括：步骤1、将具有特殊生长表型的全合成酵母或半合成酵母与正常生长表型的野生型酵母交配形成二倍体酵母菌株，然后进行生孢培养使所述二倍体酵母菌株发生减数分裂，收集所有孢子，获得杂合单倍体孢子库；或合成型染色体片段替换正常生长表型的酵母野生型染色体获得的具有特殊生长表型的半合成酵母，通过收集替换过程中因同源重组产生的所有转化子，获得杂合单倍体转化子库；步骤2、根据正常生长表型和特殊生长表型设置选择性培养条件，将杂合单倍体孢子库或杂合单倍体转化子库分为正常表型库和特殊表型库；步骤3、分别提取正常表型库和特殊表型库中所有菌株的DNA，然后设计全合成酵母或半合成酵母每个功能基因的扩增引物，称为合成型扩增引物，设计野生型酵母每个功能基因的扩增引物，称为野生型扩增引物，以本步骤所述DNA为模板分别进行混合菌落PCR扩增；步骤4、记录正常生长表型的菌株库DNA采用合成型扩增引物扩增后无法扩增出条带的功能基因位置，以及特殊生长表型的菌株库DNA采用野生型扩增引物扩增后无法扩增出条带的功能基因位置，两者重叠的功能基因位置即为引起全合成酵母或半合成酵母特殊生长表型的序列位置。...

【技术特征摘要】
1.一种定位引起全合成酵母或半合成酵母特殊生长表型的序列位置的方法，其特征在于，包括：步骤1、将具有特殊生长表型的全合成酵母或半合成酵母与正常生长表型的野生型酵母交配形成二倍体酵母菌株，然后进行生孢培养使所述二倍体酵母菌株发生减数分裂，收集所有孢子，获得杂合单倍体孢子库；或合成型染色体片段替换正常生长表型的酵母野生型染色体获得的具有特殊生长表型的半合成酵母，通过收集替换过程中因同源重组产生的所有转化子，获得杂合单倍体转化子库；步骤2、根据正常生长表型和特殊生长表型设置选择性培养条件，将杂合单倍体孢子库或杂合单倍体转化子库分为正常表型库和特殊表型库；步骤3、分别提取正常表型库和特殊表型库中所有菌株的DNA，然后设计全合成酵母或半合成酵母每个功能基因的扩增引物，称为合成型扩增引物，设计野生型酵母每个功能基因的扩增引物，称为野生型扩增引物，以本步骤所述DNA为模板分别进行混合菌落PCR扩增；步骤4、记录正常生长表型的菌株库DNA采用合成型扩增引物扩增后无法扩增出条带的功能基因位置，以及特殊生长表型的菌株库DNA采用野生型扩增引物扩增后无法扩增出条带的功能基因位置，两者重叠的功能基因位置即为引起全合成酵母或半合成酵母特殊生长表型的序列位置。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述全合成酵母为含有完整合成型染色体的酵母，所述半合成酵母为含有部分合成型染色体和部分野生型染色体的酵母。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述半合成酵母为构建全合成酵母过程中产生的酵母、全合成酵母和野生型酵母发生链交换产生的酵母或合成型染色体片段替换酵母野生型染色体产生的酵母。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述生孢培养为在生孢培养基上于25℃、200转/分钟条件下培养4-7天。5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述PCR体系如下：总体积为20μL，包括10xTaqBuffer2μL，2.5mMdNTPs2μL，10μM...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，吴毅，赵猛，李炳志，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12