本发明专利技术公开了可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体，能与恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，特异性结合；它可以通过用带His标签的DBL重组蛋白免疫小鼠，将脾细胞与Sp2/0细胞融合，用带GST标签的DBL重组蛋白初选，再用功能性多肽进行阳性筛选的方法获得；具有较强抑制虫体侵入功能，并且高于从感染有恶性疟原虫的Mali人血清中提纯的MP抗体；不能与功能性多肽特异性结合的单抗，抑制虫体侵入功能较低或没有此功能；DBL区功能性多肽，可以应用于疟疾的治疗性多肽药物的研发及防治性多肽疫苗的研制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及寄生虫学和免疫学领域。更具体地，本专利技术涉及一种可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体及恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽
技术介绍
疟原虫抗药性的产生和扩散已使全球疟疾疫情严重恶化,每年疟疾死亡人数自上世纪七十年代的约50万上升至目前约100万，药物防治疟疾的措施亦面临严重的困难和挑战。因此新的疟疾控制措施的实施已成为当务之急。疫苗接种已使许多种传染病得到有效的控制乃至根除，因此研制有效的疟疾疫苗成为防止疟原虫感染的重要手段。Pf332蛋白是由疟原虫合成，通过典型的高尔基体分泌途径运输到感染的红细胞表面，由于它是在红内期疟原虫发育晚期时分布到感染红细胞表面的，推测其可能通过影响红细胞的通透性，可塑性及有关功能的改变，促进红细胞膜的裂解和裂殖子的释放。Pf332基因编码大量富含谷氨酸的重复片段，其中五肽分子VTEEI (V)是可被中和抗体识别的表位。Pf332蛋白存在多个B、T细胞表位，可广泛地被人体识别，并诱导人体产生较高的抗体滴度。最近，有研究证明并鉴定Pf332基因由两个外显子组成。外显子I编码的富含半胱氨酸多肽段与恶性疟原虫EBL家族的Duffy-binding-like区具有高度相似性。分布在感染红细胞膜外的这段Pf332-DBL区不仅非常保守，而且在诸如3D7AH1、FCR3S1. 2、7G8的各种恶性疟原虫虫株中均有表达。除此之外，体外培养中Pf332蛋白的表达量与虫体增殖率呈正比，而且抗Pf332-DBL区的多克隆抗体可以显著降低各种虫株的侵入率。作为潜在辅助恶性疟原虫裂殖子侵入红细胞的重要分子Pf332，由于其膜外DBL区与其他膜外区蛋白质相比高度的保守性，使其成为了发展新的抗疟药物和疫苗的候选分子，因此对其功能及生物学作用的研究变得尤为重要。单克隆抗体的特点是理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易。这些优点使它一问世就受到高度重视，并成为解决生物学和医学等许多重大问题的主要手段。通过制备单克隆抗体并分析其功能，不仅可以研究蛋白质的主要生物学作用，还可以结合肽扫描技术筛选蛋白质实施功能的关键区域。抗恶性疟原虫蛋白质的单克隆抗体被广泛应用在功能蛋白质生物学作用的研究中。而目前关于抗恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区的单克隆抗体的制备及可抑制虫体侵入红细胞的单抗的筛选并未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示； 本专利技术又一个目的是提供一种可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体，它能与，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽特异性结合； 本专利技术一种可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤 1)将Pf332-DBL区基因插入带His标签的载体pQE70中，构建质粒pQE-DBL，并转染至工程菌M15中，表达带His标签的DBL重组蛋白； 2)用带His标签的DBL重组蛋白免疫小鼠，无菌摘取小鼠脾脏，在PEG1450的作用下将脾细胞与Sp2/0细胞融合，得杂交瘤细胞株； 3)将DBL片段连接到带GST标签的pGEX-4T-l载体上，并转化入BL21(DE3)中，表达带GST标签的DBL重组蛋白；步骤2)获得的杂交瘤细胞株用带GST标签的DBL重组蛋白进行阳性筛选，筛选出能够分泌抗Pf332-DBL区单抗的杂交瘤细胞株； 4)筛选出的阳性杂交瘤细胞株，再用上述的恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽进行阳性筛选，阳性即为一种可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体。一种可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332_DBL区单克隆抗体，是编号为Anti-332-mAb8或Anti- 332_mAb7的杂交瘤细胞株分沁的。本专利技术恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽，在生产疟疾的治疗性多肽药物及防治性多肽疫苗中的应用。本专利技术以恶性疟原虫cDNA为模板，通过PCR扩增，获得Pf332_DBL基因片段，将其分别连接到His标签融合表达载体pQE-70和GST标签融合表达载体pGEX_4T_l中，再分别转化相应宿主菌，进行His标签重组蛋白和GST标签重组蛋白的表达和纯化，分别命名为DBL-His和DBL-GST，为避免在单抗制备过程中筛选到假阳性单抗(即抗His标签抗体)，使用DBL-His作免疫抗原，DBL-GST作筛选用的检测抗原。用DBL-His免疫小鼠，DBL-GST包被ELISA板检测抗体效价，通过常规单抗制备技术获取抗恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区的单克隆抗体。按照Pf332-DBL区氨基酸序列顺序合成9段多肽，将多肽包被ELISA板，通过肽扫描技术对获得的单克隆抗体识别的区域进行分析，再分别选取识别不同区域的单克隆抗体各一株进行体外抑制恶性疟原虫侵入红细胞的实验。筛选到了具有较强抑制虫体侵入功能的单克隆抗体，发现了 Pf332膜蛋白质DBL区的主要功能区多肽段。本专利技术一种可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332_DBL区单克隆抗体，能与恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，特异性结合；它是通过用带His标签的DBL重组蛋白免疫小鼠，在PEG1450的作用下将脾细胞与Sp2/0细胞融合，用带GST标签的DBL重组蛋白初选，再用恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽进行阳性筛选的方法获得；具有较强抑制虫体侵入功能，并且高于从感染有恶性疟原虫的Mali人血清中提纯的MP抗体；不能与其特异性结合的单抗，抑制虫体侵入功能较低或没有此功能。在0. 5mg/mL单抗作用下，能与第I段(其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示)特异性结合的mAb8分泌的单克隆抗体，虫体侵入率为18% ;能与第4段多肽(其氨基酸序列如SEQID No. 2所示)结合的mAb7分泌的单克隆抗体为30%，而从感染有恶性疟原虫的Mali人血清中提纯的MP抗体只有35%，表明这两株单抗具有非常强的抑制虫体侵入红细胞的功能；恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽，可以应用于疟疾的治疗性多肽药物的研发及防治性多肽疫苗的研制。附图说明图I纯化的重组抗原SDS-PAGE分析，M:预染marker ； I :DBL_His重组蛋白；2: DBL-GST重组蛋白。图2纯化的重组抗原Western bloting分析,A:DBL_GST重组蛋白；B:DBL_His重组蛋白； I:Anti-GST 单抗作一抗；2: Anti-Pf332_DBL 多抗作一抗；3:Anti-His 单抗作一抗；4:Anti-Pf332-DBL 多抗作一抗。图3单克隆抗体特异性识别重组抗原DBL-GST的Western bloting分析,M:预染marker ； 1-12: Anti- 332-mAb 1,2,3,4, 5,6,7,8,9, 10, 11, 12 作一抗。图4单克隆抗体特异性识别天然蛋白Pf332的Western bloting分析，M本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽，其氨基酸序列如SEQID No. 2所示。2.可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体，其特征在于它能与权利要求I所述的恶性疟原虫Pf332膜蛋白质DBL区功能性多肽特异性结合。3.可抑制恶性疟原虫侵入的抗Pf332-DBL区单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤 1)将Pf332-DBL区基因插入带His标签的载体pQE70中，构建质粒pQE-DBL，并转化至工程菌M15中，表达带His标签的DBL重组蛋白； 2)用带His标签的DBL重组蛋白免疫小鼠，在PEG1450的作用下将脾细胞与Sp2/0细胞融合...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜宁，陈启军，杜承，尹继刚，陆慧君，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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