本发明专利技术涉及一种结核分枝杆菌利福平耐药突变的检测方法及试剂盒，更具体地说，本发明专利技术涉及一种结核分枝杆菌利福平耐药突变的检测方法及试剂盒和应用。本发明专利技术还提供了设计在rpoB基因利福平耐药决定区相关区域的、具有高度的特异性的引物组。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学检测领域，具体地，本专利技术涉及一种结核分枝杆菌利福平 耐药突变的检测方法及试剂盒，更具体地说，本专利技术涉及一种结核分枝杆菌利福平耐药突 变的检测方法及试剂盒和应用。本专利技术还提供了设计在rpoB基因利福平耐药决定区相关 区域的、具有高度的特异性的引物组。
技术介绍
结核分枝杆菌（Mycobacterium1:ube;rculosis)简称结核杆菌（TB),于1882年由 德国细菌学家郭霍（RobedKoch)从肺结核病人姨标本中发现，是结核病的病原菌。结核病 是一种具有强传染性的慢性消耗性疾病，其发病率较高，危害性极大，19世纪时被称为"白 色癌疫"。世界卫生组织（Wffi))已将结核病与艾滋病、追疾列为二十一世纪人类需要攻克的 H大传染性疾病之一，1993年，WHO宣布全球结核病处于"紧急状态"，并于1995年起将每年 的3月24日定为"世界防治结核病日"，W提醒公众加深对结核病的认识。据Wffi)报告，全 球约20亿人曾受到结核分枝杆菌感染，现有肺结核病人约2000万，每年新发病例800万~ 1000万，每年死于结核病的人数约300万。我国是结核病第二大国，仅次于印度，估计全国 现有活动性肺结核病人450万，每年新发病例130万，相当于其他传染病的总和。[000引利福平化ifampicin，RFP)是抗结核联合化疗中主要的一线药物，在细菌中的革己 蛋白为RNA聚合酶目亚基，与之结合后，阻碍mRNA合成，抑制转录过程，阻断细菌的蛋白质 合成，从而达到抑菌作用。 结核耐药性快速诊断方法对结核病的防治具有重要价值。现有的结核分枝杆菌利 福平耐药性检测所使用的方法，有绝对浓度法、RFLP法和测序法等。 其中，绝对浓度法存在着二次培养，每次八周，周期长且污染机率高；RFLP法由于 采用限制性内切酶，而RFP耐药决定区内缺少合适的酶切位点，导致rpoB基因突变的检出 率仅为10%，不能满足临床诊断的要求；虽然测序法是突变检测的"金标准"，但敏感性低 (15%~20% )，且阴性率高。 在过去的几十年里涌现出了越来越多的SNPs分析技术，送些技术大致可W分为 两类：等位基因特异性区分法W及直接测序法。其中，等位基因特异性区分策略主要是基于 等位基因特异性反应，包括：引物延伸、杂交、连接、限制性酶切等方法。但是送些方法都不 够理想，它们中，有的方法需要复杂的操作和昂贵的仪器，有的方法灵敏度和特异性不佳， 无法检测稀有突变，送些都限制了它们的广泛应用。例如，SNP检测技术中最常见的等位基 因特异性PCR技术（allelic-specificPCR，AS-PCR)，虽然引物3' -末端和模板形成了错配， 但是大部分DNA聚合酶依然能够催化引物的非特异性延伸，因而无法准确地判断所测基因 中是否存在SNP。因此，本领域亟待研制和开发一种高度灵敏、准确的结核分枝杆菌利福平耐药基 因突变检测技术，其对于早期诊断结核病和防治结核病的传播具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种高度灵敏、准确、特异性强的结核分枝杆菌利福平耐 药基因突变检测手段、检测试剂盒W及相关用途和应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种用于检测结核分枝杆菌利福平耐药相关基因的 待测突变位点上是否存在突变的检测试剂盒，所述试剂盒中包括： 正向引物和反向引物， 其中，所述正向引物和反向引物中一个引物为辨别性引物，所述辨别性引物W其 3'末端碱基起算第1-8位的任意1个或多个碱基对应待测突变位点，但与野生型或突变型 序列相应区段上碱基序列完全匹配，并且所述的辨别性引物的3'末端核巧戊糖3号C的居 基是双脱氧修饰的C(即ddC); 并且所述正向引物和反向引物中另一引物位于基因突变位点下游或上游且与相 应区段上碱基序列完全匹配；[001引高保真DNA聚合酶；和 非高保真DNA聚合酶； 其中，所述的正向引物和/或反向引物用于扩增含所述待测突变位点的扩增产 物；并且所述的待测突变位点选自下组： 巧OB基因的对应于巧OB蛋白中第516位氨基酸的密码子序列、第526位氨基酸密 码子序列、第531位氨基酸的密码子序列、或其组合。 在另一优选例中，所述的待测突变位点上的碱基序列突变形式选自下组；D516V、 册26Y、册26R、S531L、或其组合。[001引在另一优选例中，所述的待测突变位点的碱基序列选自下组；GAC-GTC、CAC-TAC、CAC-CGC、TCG-TTG、或其组合。 在另一优选例中，所述的辨别性引物选自下组： (1)、化sion-D516V-Blocked-F;5'-TGTAGTCCCGTGCATGAAGGCGCCAGCTGAGCC AATTCATGGA-ddC-3'（SEQIDNO: 1); 但）、Rision-526-Blocked-F;5'-TGTAGTCCCGTGCATGAAGGCGCTGTCGGGGTTGAC CCA-ddC-3'(SEQIDNO:2)； (3)、Rision-S531L-Blocked-F;5'-TGTAGTCCCGTGCATGAAGGCCCCACAAGCGCC GACTGT-ddC-3'(SEQIDNO:3)；[002引或其组合。 在另一优选例中，所述的试剂盒中含有用于检测二个或多个待测突变位点的二个 或多个辨别性引物，并且与所述辨别性引物配对使用的另一正向引物和/或反向引物是共 用引物。 在另一优选例中，所述的共用引物为：TB-Primer-R;5,-CCGATGTTGGGCCCCTC-3,（SEQIDNO:4); 在另一优选例中，所述的共用引物是不经任何修饰，或经修饰的。 在另一优选例中，所述的二个或多个辨别性引物在其5'端设有通用引物结合区。 在另一优选例中，所述的通用引物结合区的长度为15-2化P。 在另一优选例中，所述的通用引物区为TGTAGTCCCGTGCATGAAGGC(SEQIDNO: 5)。 在另一优选例中，所述试剂盒还包括W下通用引物：Adaptor-TB-F：5'-TGTAGTCCCGTGCATGAAGGC-3'(SEQIDNO: 5) 在另一优选例中，所述的试剂盒设有盒体、扩增试剂、对照试剂和提取试剂， 所述扩增试剂、对照试剂和提取试剂放置在盒体内，所述扩增试剂包括TB-D516V-Mix、 TB-526-Mix、TB-S531L-Mix和TB-enzyme-Mix，所述对照试剂包括TB-D516V-PC(positive control)、TB-册26Y-PC、TB-册26R-PC、TB-S531kPC和TB-NC(negativecontrol)，所述提 取试剂为TBDNA提取液。 在另一优选例中，在所述的试剂盒中， 1)、所述的TB-D516V-Mix包括IOmMTris-肥1(抑8. 3)、50mMKC1、1.SmMMgC12、 200yMdNTPMixture、0. 2yMAdaptor-TB-F、F^ision-DSlGV-Blocked-F和TB-Primer-R各 0. 3yM;2)、所述的TB-526-Mix包括IOmMTris-肥I(p册.3)、50mMKC1、1. 5mMMgC12、 200yMdNTPMix1:ure、0. 2yM本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测结核分枝杆菌利福平耐药相关基因的待测突变位点上是否存在突变的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：正向引物和反向引物，其中，所述正向引物和反向引物中一个引物为辨别性引物，所述辨别性引物以其3'末端碱基起算第1‑8位的任意1个或多个碱基对应待测突变位点，但与野生型或突变型序列相应区段上碱基序列完全匹配，并且所述的辨别性引物的3'末端核苷戊糖3号C的羟基是ddC；并且所述正向引物和反向引物中另一引物位于基因突变位点下游或上游且与相应区段上碱基序列完全匹配；高保真DNA聚合酶；和非高保真DNA聚合酶；其中，所述的正向引物和/或反向引物用于扩增含所述待测突变位点的扩增产物；并且所述的待测突变位点选自下组：rpoB基因的对应于rpoB蛋白中第516位氨基酸的密码子序列、第526位氨基酸密码子序列、第531位氨基酸的密码子序列、或其组合。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张驰宇，樊路娟，姚瑾，蓝柯，
申请(专利权)人：中国科学院上海巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31
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