一种用于鉴定新孢子虫的LAMP引物组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定新孢子虫的LAMP引物组及其应用。本发明专利技术提供了一种引物组，由序列表的序列1所示的单链DNA分子、序列表的序列2所示的单链DNA分子、序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成。所述引物组的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定新孢子虫；(b)检测待测生物样本中是否含有新孢子虫。本发明专利技术提供了用于检测新孢子虫的引物组，建立一种快速，便捷的LAMP检测方法，为新孢子虫的快速诊断提供新方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，设及一种鉴定寄生虫的LAMP引物组W及应用所述引 物组鉴定寄生虫的方法，具体设及一种鉴定新抱子虫的LAMP引物组W及应用所述引物组 鉴定新抱子虫的方法。
技术介绍
新抱子虫属于顶复口（F*h}dumApicomplexa)、抱子虫纲（Sporozoasida)、球虫 亚纲（Coccidia)、真球虫目巧ucoccidiida)、肉抱子虫科（Sarco巧stidae)、新抱子虫属 (化ospora)，其形态与弓形虫相似，是专性细胞内寄生虫。1984年，Bjerkas于挪威的病犬 中首次发现此寄生虫，但是并没有对此寄生虫进行鉴别，误认为是弓形虫。直到1988年，美 国学者Dubey发现感染此病与弓形虫类似，但是其超微结构与弓形虫明显不同，因为在患 有肌炎的病犬中发现，因此正式命名为犬新抱子虫（N.caninum)。1999年，Tranas发现可W 在人的血清中检测到新抱子虫的抗体，但是目前还没有在人体内发现新抱子虫体的报道。 新抱子虫是引起世界性范围内的奶牛及黄牛流产的主要原因之一，为养殖户带来严重的经 济损失。目前最有效的防治的方法是通过对检测后确定感染病及疑似患病牛进行淘汰、焚 烧、掩埋等处理，建立无新抱子虫感染的牛群。因此建立快速，准确的检测新抱子虫的方法 尤为重要。 检测新抱子虫的方法主要有病原学检测、免疫学检测及分子生物学检测等方法， 目前研究比较多的为分子生物学检测，其中包括常规PCR、巧光PCR、基因忍片W及在它们 基础上发展起来的巢式PCR、二溫式PCR、实时巧光PCR等。运些检测方法共有的缺点如下： 反应时间过长；随着时间、环境的改变实验结果可能出现污染、不稳定等现象。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于鉴定新抱子虫的LAMP引物组及其应用。本专利技术提供了一种引物组，由序列表的序列1所示的单链DNA分子（F3-1)、序列表 的序列2所示的单链DNA分子度3-1)、序列表的序列3所示的单链DNA分子（FIP-I)和序 列表的序列4所示的单链DNA分子度IP-1)组成。所述引物组的功能为如下（a)或化）： (a)鉴定或辅助鉴定新抱子虫；化）检测待测生物样本中是否含有新抱子虫。 本专利技术还保护所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下（a) 或化）：(a)鉴定或辅助鉴定新抱子虫；(b)检测待测生物样本中是否含有新抱子虫。 本专利技术还保护含有所述引物组的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下（a)或化）： (a)鉴定或辅助鉴定新抱子虫；化）检测待测生物样本中是否含有新抱子虫。 本专利技术还保护所述试剂盒的制备方法，包括将所述引物组中的各条引物进行独立 包装的步骤。 本专利技术还保护一种鉴定或辅助鉴定新抱子虫的方法，包括如下步骤： (1)提取待测微生物的基因组DNA; (2)W步骤（I)提取的基因组DM为模板，采用所述引物组进行环介导等溫扩增； 如果采用所述引物组可W实现W所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测微生物为或候 选为新抱子虫；如果采用所述引物组不能实现W所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待 测微生物为或候选为非新抱子虫。 所述待测微生物具体可为新抱子虫、弓形虫、牛环形泰勒虫、牛双芽己贝斯虫或牛 瑟氏泰勒虫。 本专利技术还保护一种检测待测生物样本中是否含有新抱子虫的方法，包括如下步 骤： (1)提取待测生物样本的总DNA; (2)W步骤（1)提取的总DNA为模板，采用所述引物组进行环介导等溫扩增；如果 采用所述引物组可W实现W所述总DNA为模板的特异性扩增，所述待测生物样本含有或疑 似含有新抱子虫；如果采用所述引物组不能实现W所述总DNA为模板的特异性扩增，所述 待测生物样本不含有或疑似不含有新抱子虫。 W上任一所述待测生物样本具体可为离体的动物样本。 W上任一所述环介导等溫扩增的25y1初始反应体系中，F3的含量可为5pmol，B3 的含量可为5pmol，FIP的含量可为40pmol，BIP的含量可为40pmol。 阳0化]所述环介导等溫扩增的反应体系具体可为（25y1):溶剂为40mMTris?肥1缓 冲液（抑8. 8);含模板DNAJOmMKCl、l6mM(NH4)2S〇4、〇. 2% (体积比）Tween2〇、l.6M甜菜 碱、16mMM拆04、2.SmMdNTP(指的是四种dNTP中每种的浓度）、16UBstDNApolymerase、 40pmolFIP、40pmolBIP、5pmolF3 和 5pmolB3。 W上任一所述环介导等溫扩增的反应条件为：60-65°C，45-60min。 W上任一所述环介导等溫扩增的反应条件具体为：63°C，60min。[OOW"采用所述引物组可W实现W所述基因组DNA为模板的特异性扩增"的判断标准具 体如下：采用实时浊度仪监测，出现阳性扩增曲线。 阳02引"采用所述引物组不能实现W所述基因组DNA为模板的特异性扩增"的判断标准具 体如下：采用实时浊度仪监测，没有出现阳性扩增曲线。 采用本专利技术提供的引物组并通过环介导等溫扩增检测新抱子虫，具有如下优点： ①高特异性：4条引物对新抱子虫祀序列的6个特异区域的识别保证了LAMP扩增 的高度特异性，能从相差仅一个核巧酸的基因标本中找出相应的祀序列进行扩增； 阳02引②高灵敏度：灵敏度比普通PCR高100倍； ③结果鉴定简便：可通过浊度仪直接判断结果，也可添加染料并通过用肉眼观察 显色情况； ④操作简单：只要将检测样品（祀核酸）和检测试剂一起放入60-65°C实时浊度 仪中45-60min后就可W判断结果。 本专利技术为新抱子虫检测提供了新的技术平台，可用于畜牧业生产单位筛查和检测 新抱子虫，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。【附图说明】 图1为实施例2的步骤一的结果。 图2为实施例2的步骤二的结果。 图3为实施例3的步骤一的结果。 图4为实施例3的步骤二的结果（本专利技术提供的方法）。[003引图5为实施例3的步骤二的结果（现有的PCR方法）。 图6为实施例4的结果（第一次重复试验）。 图7为实施例4的结果（第二次重复试验）。 图8为实施例4的结果（第二次重复试验）。【具体实施方式】W下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。W下实施例中的定量试验，均设置=次重复实验，结果取平 均值。 阳03引新抱子虫：ATCr50977?。弓形虫：ATCT50839?。牛双芽己贝斯虫：ATCC" 75575?。 提及"牛环形泰勒虫"的文献：盛明宏，于建敏，王志亮，张西臣.羊泰勒虫PCR 检测方法的建立和初步应用.中国动物检疫，2007, 24 (7). W40] 提及"牛瑟氏泰勒虫"的文献：许应天，高旭，武振久，张守发，张西 臣.Wp33重组蛋白为抗原建立牛瑟氏泰勒虫病间接化ISA诊断方.中国兽医杂 志，2008, 43 (4) 13-14. 实施例中，均采用荣研生物科技（中国）有限公司的环介导等溫扩增实时浊度仪 LA-320C对反应体系的浊度进行实时监测。 实施例1、引物的设计和制备 基于大量序列比对，引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
引物组，由序列表的序列1所示的单链DNA分子、序列表的序列2所示的单链DNA分子、序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列表的序列4所示的单链DNA分子组成；所述引物组的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定新孢子虫；(b)检测待测生物样本中是否含有新孢子虫。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王伟利，孟庆峰，姚贵哲，宫鹏涛，张西臣，
申请(专利权)人：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：吉林;22