饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了鉴定沙门氏菌的PCR扩增引物及探针引物，包括：沙门氏菌引物正向序列：5＇‑GCGGCGTTGGAGAGTGATA‑3＇，反向序列；5＇‑AGCAATGGAAAAAGCAGGATG‑3＇；探针序列：5＇‑FAM‑CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT‑TAMRA‑3＇；一种饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：称取样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打，稀释为1:10的样品匀液，进行增菌培养，得到增菌液；提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；获得鉴定沙门氏菌的PCR扩增引物及探针引物；将所得DNA进行微滴数字PCR扩增，获得反应液；对反应液进行检测与分析。结果表明该引物对沙门氏菌的扩增具有特异性；同时微滴数字PCR对其扩增稳定，具有重复性；取浓度为10

Detection method of Salmonella in feed by micro droplet digital PCR

The present invention discloses PCR amplification primers and probe primers for identification of Salmonella, including: Salmonella primers forward sequence: 5 'GCGGCGTTGGAGAGTGATA 3', reverse sequence, 5 'AGCAATGGAAAAAGCAGGATG 3'; probe sequence: 5 'FAM CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT TAMRA 3'; a kind of sand gate in feed The micro drop digital PCR detection method, including the following steps: taking samples to the homogeneous bag full of 225mL sterile culture, flapping with a slap homogenizer, diluting the sample at 1:10, and cultivating the bacteria, obtaining the bacteria increasing fluid, extracting the samples to be tested, positive control and negative control DNA, and obtaining the identification of Salmen. The PCR amplification primers and probe primers of the bacteria were amplified. The DNA was amplified by digital PCR, and the reaction solution was obtained. The reaction solution was detected and analyzed. The results showed that the primer was specific for the amplification of Salmonella, and the number of PCR was stable and reproducible, and the concentration was 10.

【技术实现步骤摘要】
饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法。
技术介绍
微滴数字PCR（ddPCR）是近年来发展起来的可以定量检测DNA的新方法，通过PCR扩增和荧光信号的积累读取阳性微滴数目。微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。该方法不需要核酸标准品，又兼具qPCR的优势。开发了高灵敏，高选择性的检测饲料中性致病菌的新方法。沙门氏菌是常见的食源性病原菌。沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。它能引起人和动物很多重大疾病，其广泛存在于自然界中。沙门氏菌传播途径多，比如肉、蛋及食品运输等过程中的感染。肉及其制品的沙门氏菌检出本文档来自技高网...

【技术保护点】
饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法，它包括如下步骤：1）称取25g沙门氏菌样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打，稀释为1:10的样品匀液；沙门氏菌样品的增菌培养按照GB 4789.4进行；非目标菌株增菌采用LB培养液在36℃下培养20‑30h；获得样品及对照组的增菌液；2）提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；3）获得鉴定沙门氏菌的PCR扩增引物及探针引物；4）将步骤2）所得DNA进行微滴数字PCR扩增，获得反应液；所述的微滴数字PCR反应体系为20μL，各成分含量为：2×ddPCR 预混液10μL，上下游引物（10 µmol/L）各1μL，探针引物（10 µm...

【技术特征摘要】
1.饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法，它包括如下步骤：1）称取25g沙门氏菌样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打，稀释为1:10的样品匀液；沙门氏菌样品的增菌培养按照GB4789.4进行；非目标菌株增菌采用LB培养液在36℃下培养20-30h；获得样品及对照组的增菌液；2）提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；3）获得鉴定沙门氏菌的PCR扩增引物及探针引物；4）将步骤2）所得DNA进行微滴数字PCR扩增，获得反应液；所述的微滴数字PCR反应体系为20μL，各成分含量为：2×ddPCR预混液10μL，上下游引物（10µmol/L）各1μL，探针引物（10µmol/L）1μL，模板DNA4μL，双蒸水3μL；反应条件为：95℃/5min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；98℃/10min（1℃/s），12℃保存反应产物；体系完成后，进行数字PCR反应；5）对步骤4）的反应液进行检测与分析。2.根据权利要求1所述的饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于：步骤3）中所述的鉴定沙门氏菌的PCR扩增引物及探针引物，包括：沙门氏菌引物正向序列：5＇-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3＇，反向序列；5＇-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3＇；探针序列：5＇-FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：王准，聂丹丹，李文君，杨帆，王玮琳，李忠起，彭勃，罗雁非，刘金华，刘韬，
申请(专利权)人：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：吉林,22