一种立克次氏体巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法技术

一种立克次氏体巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法，本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，本方法检测非常方便快捷，并能提高检测方法的特异性及敏感性，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，针对立克次氏体的pCS20为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，解决了现有PCR检测技术低特异性和低敏感性，扩增时容易产生假阳性、蜱虫体内立克次氏体含量较低时容易漏检的缺陷，本发明专利技术方法反应特异性更强、敏感性更高，该方法专用于立克次氏体精准检测，应用前景广阔。

A nested PCR specific primer and detection kit for Rickettsia and nested PCR detection method

A Rickettsia nested PCR specific primer, detection kit and nested PCR detection method, the template DNA preparation process of this method is simple and low cost, this method is very convenient and quick to detect, and can improve the specificity and sensitivity of detection methods, single ticks and even tick parts of the tissue organs extracted from the micro genome DNA As a template, 4 specific primers are designed according to the specific region of pCS20 as the target gene of Rickettsia, which can solve the defects of low specificity and low sensitivity of current PCR detection technology, easy to produce false positive, and easily leak detection when the content of tick Chong Senerickettsy body is low. The method is more specific and sensitive. This method is suitable for precise detection of Rickettsia and has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种立克次氏体巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法
本专利技术具体涉及生物学
，具体涉及一种立克次氏体巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法。
技术介绍
立克次氏体是一类依赖于宿主细胞和专性细胞内寄生的小型革兰氏阴性原核单细胞微生物，介于细菌和病毒之间，较接近于细菌。由立克次氏体引起的疾病统称立克次氏体病，是一种人畜共患的自然疫源性疾病，人被感染立克次氏体的媒介昆虫叮咬或接触其粪便可被感染。该病在历史上曾经严重威胁人类健康，造成灾难，目前已成为世界性关注的疾病。人类立克次氏体病的传染源主要是感染的家畜，特别是牛和羊。在动物之间，该病原体以蜱为传播媒介进行传播并可以经卵传代，从而形成自然疫源地。动物感染立克次氏体后多呈亚临床经过，但绵羊和山羊有时出现食欲不振，体质量下降，产奶量减少和流产、死胎等现象；牛可出现不育和散在性流产。立克次氏体的临床诊断主要的方法是直接镜检、血清学诊断(酶联免疫吸附实验和间接免疫荧光试验)、常规PCR检测及病原分离等。直接镜检只能用于对发病动物的检测，但对疫病普查和进出口检疫则有困难。血清学诊断主要是间接免疫荧光分析，但是此本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种立克次氏体巢式PCR特异性引物，其特征在于，包括设计的两对特异性引物，具体为：外引物EF1∶5′‑TTT‑CCC‑TAT‑GAT‑ACA‑GAA‑GGT‑AAC‑3′；内引物ER1：5′‑AAA‑GCA‑AGG‑ATT‑GTG‑ATC‑TGG‑ACC‑3′；外引物EF2：5′‑ACT‑AGT‑AGA‑AAT‑TGC‑ACA‑ATC‑TAT‑3′；内引物ER2：5′‑TGA‑TAA‑CTT‑GGT‑GCG‑GGA‑AAT‑CCT‑T‑3″。

【技术特征摘要】
1.一种立克次氏体巢式PCR特异性引物，其特征在于，包括设计的两对特异性引物，具体为：外引物EF1∶5′-TTT-CCC-TAT-GAT-ACA-GAA-GGT-AAC-3′；内引物ER1：5′-AAA-GCA-AGG-ATT-GTG-ATC-TGG-ACC-3′；外引物EF2：5′-ACT-AGT-AGA-AAT-TGC-ACA-ATC-TAT-3′；内引物ER2：5′-TGA-TAA-CTT-GGT-GCG-GGA-AAT-CCT-T-3″。2.一种立克次氏体巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的巢式PCR检测试剂盒包括以下组分：(一)权利要求1所述的两对特异性引物；(二)阳性对照：所述的阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，该质粒含立克次氏体993bp基因片段；(三)阴性对照：所述的阴性对照为去离子水；(四)Taq酶。3.根据权利要求2所述的立克次氏体巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照通过将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得为阳性重组质粒的阳性对照。4.一种采用权利要求1所述的特异性引物的立克次氏体巢式PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)被检标本DNA提取：取花蜱数只，酒精清洗，每只蜱放入单独的1.5mlEPdof管，200μLPBS液浸没蜱，用样品破碎仪破碎蜱的虫体，吸取破碎后的溶液，加入Trizol试剂裂解，采用常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，-20℃保存备用；(2)以权利要求1中的外引物EF1、ER1扩增：在EPdof管中加入处理后的蜱标本DNA，同时设阴、阳性对照，10×PCRBuffer，Mgcl2，dNTP，Taq酶，25pmol/μLEF1，25pmol/μLER1，DNA模板，ddH2O混匀后稍离心的50μL反应体系中进行第一轮PCR；(3)以权利要求1中的内引物E...

【专利技术属性】
技术研发人员：王素华，帅江冰，张晓勇，吕继洲，袁淑辉，张晓峰，吴绍强，
申请(专利权)人：王素华，
类型：发明
国别省市：浙江,33