一种明胶中貉源性成分实时荧光PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种明胶中貉源性成分实时荧光PCR检测的引物和探针以及优化方法，具有良好的灵敏性和特异性，方法，其步骤如下：a.提取待检明胶样品中DNA；b.以提取的DNA为模板，加入上述的引物和带荧光染料的探针以及酶反应液进行实时荧光PCR反应，记录样本反应的扩增曲线和Ct值，根据扩增曲线和Ct值判定结果；实时荧光PCR反应体系为：2×Real‑time PCR预混液；10µmol/L貉特异基因上游引物；10µmol/L貉特异基因下游引物；10µmol/L貉特异基因探针；1~100 ng/μL模板DNA；通过上述方法，明胶中是否含有貉源性成分，而完成了食品检测体系。

A real-time fluorescence PCR method for detecting the source of raccoon dog in gelatin

The invention discloses a primer and probe and an optimization method for real-time fluorescence PCR detection of raccoon dog source in gelatin. The method has good sensitivity and specificity. The steps are as follows: A. extracts DNA in the sample of gelatin; B. takes the DNA as the template, adding the primers and the probe with the fluorescent dye and the enzyme reaction. The real-time fluorescence PCR reaction was carried out to record the amplification curve and Ct value of the sample reaction, and the results were determined according to the amplification curve and Ct value. The real time fluorescence PCR reaction system was 2 x Real time PCR premixture, the upstream primers of the specific gene of the raccoon raccoon raccoon raccoon raccoon raccoon raccoon dog, 10 downstream primers of the specific gene of the raccoon raccoon raccoon raccoon dog, and the specific gene probe of the 10 mol/L raccoon dog; 1~1 00 ng/ L template DNA; through the above method, whether gelatin contains raccoon source components, and completed the food detection system.

【技术实现步骤摘要】
一种明胶中貉源性成分实时荧光PCR检测方法
本专利技术属于食品检验
，具体涉一种明胶中貉源性成分实时荧光PCR检测方法。
技术介绍
实时荧光PCR技术是基于普通PCR技术发展而来的，在扩增反应体系中添加一个特异性探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，以进行结果判定，可以有效降低检测结果假阳性，具有灵敏度强、特异度高、操作简单、快速等优点。明胶是从动物表皮、结缔组织和骨组织中的胶原部分水解得到的不溶性蛋白质，由于其特殊的物理特性、营养价值和药用功能，被作为辅料或药物广泛应用于食品、医药和其他工业领域。用于明胶生产的动物材料多为屠宰场提供的牛、猪、羊等的皮毛和骨头。目前对动物明胶的来源检测缺乏相应的检测手段，国内对动物胶的检测，也只集中在对鹿胶、龟胶和阿胶的真伪鉴别上。在明胶市场中，经常出现明胶掺假现象。掺假主要体现在不法商贩通过降低成本以谋取经济利益，在明胶加工过程中，以低价格的原料骨（肉）掺入到高价格的原料骨中。貉作为一种毛皮动物，饲养者将其杀完去皮张后，往往又将其骨（肉）贱卖给不法商贩，令貉骨（肉）得以添加到某些价格较高的动物骨中如牛骨、羊骨、猪骨等，以次充好。迄今我国还没有对明胶制品中貉子源性成分的定性检测方法，食品质控工作面临无据可依的困境。以貉骨（肉）冒充高成本动物骨，这一违法行为既无法保证明胶生产原料的卫生要求，可能产生食品安全问题，又属于以次充好的行为，影响明胶的质量，欺诈消费者。所以在食品质量控制工作中，找到动物明胶中貉源性成分的检测方法，识别并打击假冒伪劣明胶，对于保障消费者权益和身体健康有着重要意义，对于保护我国明胶产品质量及其经济效益也具重要意义。目前在食品检验
中，检测明胶中貉源性成分的工作有待开展，为了更好地应对工作需求，本领域技术人员迫切需要掌握一种快速、简便以及准确地检测和鉴定明胶中貉源性成分的技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是为解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种明胶中DNA提取的优化方法，提供一种明胶中貉源性成分实时荧光PCR检测的引物和探针以及优化方法。本专利技术所述的貉，中文学名貉子，是指哺乳动物，属哺乳纲，食肉目，犬科，貉属。被毛长而蓬松，外形粗短、肥胖，嘴尖细，四肢细短。本专利技术的一方面在于，公开明胶中DNA提取的优化；蛋白沉淀法：称取25mg明胶样品4管，分别加入到1.5mL离心管中，在管中加入1mL核酸裂解液,置65℃恒温箱中温育20min，在65℃条件下加入600uL蛋白沉淀液，室温下12000r/min离心10min，小心转移上清液至一新1.5mL离心管中，再加入0.8倍体积的异丙醇，混匀，室温放置2h左右，12000r/min离心10min，弃上清液，加入600uL70%乙醇洗涤1次，12000r/min离心5min，弃上清液，室温干燥后，将DNA溶于10uL去离子水中，-20℃保存；裂解抽提法：称取25mg明胶样品4管，分别加入到1.5mL离心管中，在管中加入600uL的核酸裂解液，置65℃恒温箱中温育20min，在65℃条件下加入等体积的酚/三氯甲烷/异戊醇(体积比25：24:1)，室温下12000r/min离心10min，小心转移上清液至一新的1/5mL离心管中，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(体积比24：1)，剧烈振荡，室温下12000r/min离心10min，小心转移上清液至一新的1.5mL离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，混匀，室温放置2h左右，12000r/min离心10min，弃上清液，加入600uL70%乙醇洗涤一次，12000r/min离心5min，弃上清液，室温干燥后，将DNA溶于10uL去离子水中，-20℃保存；利用分光光度计对提取的DNA进行DNA浓度和纯度测定；蛋白沉淀法所提取的样品DNA的OD260/OD280比值分别为5.3254，4.3117，2.9319和5.8956，远远在双链DNA有效纯度1.8的范围之外；而裂解抽提法所提取的所有样品DNA的OD260/OD280比值分别为1.8366，1.7514，2.0388和1.7728，均在1.8~2.0左右，因此方法裂解抽提法的DNA提取效果较蛋白沉淀法更好，更适合于作为明胶中的DNA提取方法。本专利技术的一方面在于，公开明胶中貉源性成分检测用物种特异性引物和探针，其包括以下碱基序列：实时荧光PCR检测明胶中貉源性成分的引物和探针，碱基序列分别为：貉特异基因上游引物：CTATACCTGGCATCTGGTTCTTACC；貉特异基因下游引物：GTCCCATTTGAGTGGATTAGTAGGA；带荧光染料的貉特异基因探针：CAGGGCCATGAACTCCCTCCATCC；所述的荧光染料，5’端为FAM标记，3’端为TAMRA标记。本专利技术的一方面还在于，公开明胶中貉源性成分实时荧光PCR检测的优化方法，其步骤如下：a.提取待检明胶样品中DNA；b.以提取的DNA为模板，加入上述的引物和带荧光染料的探针以及酶反应液进行实时荧光PCR反应，记录样本反应的扩增曲线和Ct值，根据扩增曲线和Ct值判定结果；所述的实时荧光PCR反应体系为：2×Real-timePCR预混液10µL10µmol/L貉特异基因上游引物1µL10µmol/L貉特异基因下游引物1µL10µmol/L貉特异基因探针1µL1~100ng/μL模板DNA5µL双蒸水2µL所述的实时荧光PCR反应条件为95℃/10min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，45个循环，在每次循环的60℃/1min时收集荧光；所述的样本设2个重复，以Ct平均值作为最终结果；所述实时荧光PCR检测的优化方法还设有空白对照、阴性对照、阳性对照和内参基因，判定标准为：空白对照：以双蒸水为模板，按照所述的实时荧光PCR检测反应体系和反应条件，进行实时荧光PCR反应，检测无FAM荧光信号，相应Ct值>40；阴性对照：以非貉源性物种DNA为模板，按照所述的实时荧光PCR检测反应体系和反应条件，进行实时荧光PCR反应，检测无FAM荧光信号，相应Ct值>40；阳性对照：按照所述的实时荧光PCR检测反应体系和反应条件，进行模板DNA实时荧光PCR反应，检测有FAM荧光信号，且FAM通道出现明显的扩增曲线，相应Ct值≤36；内参基因：以内参基因为模板，按照所述的实时荧光PCR检测反应体系和反应条件，进行实时荧光PCR反应，相应Ct值在20-35之间；否则判定为PCR无效；待测样品貉源性基因检测Ct值大于或等于40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品未检出貉源性成分；待测样品貉源性基因检测Ct值小于或等于36，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品检出貉源性成分；待测样品貉源性基因检测Ct值在36-40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次扩增后的结果Ct值仍小于40，且阴性对照和阳性对照结果正常，判定该样品检出貉源性成分；再次扩增后结果Ct值大于40，且阴性对照、阳性对照结果正常，判定该样品未检出貉源性成分；所述的内参基因碱基序列分别为：内参基因上游引物：AGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATG；内参基因下游引物：TCCAGTATGCTTACCTTGTTACGA；带荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.实时荧光PCR检测明胶中貉源性成分的引物和探针，碱基序列分别为：貉特异基因上游引物： CTATACCTGGCATCTGGTTCTTACC；貉特异基因下游引物： GTCCCATTTGAGTGGATTAGTAGGA；貉特异基因探针： CAGGGCCATGAACTCCCTCCATCC，其特征在于：所述的貉特异基因探针带荧光染料，5’端为FAM标记，3’端为TAMRA标记。

【技术特征摘要】
1.实时荧光PCR检测明胶中貉源性成分的引物和探针，碱基序列分别为：貉特异基因上游引物：CTATACCTGGCATCTGGTTCTTACC；貉特异基因下游引物：GTCCCATTTGAGTGGATTAGTAGGA；貉特异基因探针：CAGGGCCATGAACTCCCTCCATCC，其特征在于：所述的貉特异基因探针带荧光染料，5’端为FAM标记，3’端为TAMRA标记。2.实时荧光PCR检测明胶中貉源性成分的方法，其步骤如下：a.提取待检明胶样品中DNA；b.以提取的DNA为模板，加入权利要求1所述的引物和探针以及酶反应液进行实时荧光PCR反应，记录样本反应的扩增曲线和Ct值，根据扩增曲线和Ct值判定结果。3.根据权利要求2所述的实时荧光PCR检测明胶中貉源性成分的方法，其特征在于：所述的实时荧光PCR反应体系为：2×Real-timePCR预混液10µL，10µmol/L貉特异基因上游引物1µL，10µmol/L貉特异基因下游引物1µL，10µmol/L貉特异基因探针1µL，1~100ng/μL模板DNA5µL双蒸水2µL。4.根据权利要求3所述的实时荧光PCR检测明胶中貉源性成分的方法，其特征在于：所述的实时荧光PCR反应条件为95℃/10min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，45个循环，在每次循环的60℃/1min时收集荧光。5.根据权利要求4所述的实时荧光PCR检测明胶中貉源性成分的方法，其特征在于：所述的样本设2个重复，以Ct平均值作为最终结果。6.根据权利要求5所述的实时荧光PCR检测明胶中貉源性成分的方法，其特征在于：所述实时荧光PCR检测方法还设有空白对照、阴性对照、阳性对照和内参基因，判定标准为...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金华，王岸英，刘婧，聂丹丹，罗雁非，王玮琳，曲辉，吴鑫本，
申请(专利权)人：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：吉林,22