华北地区棉花蚜虫及其寄生蜂检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了华北地区棉花蚜虫及其寄生蜂检测试剂盒。本发明专利技术的试剂盒包括两个多重PCR和三个单重PCR检测体系，两个多重PCR检测体系使用的特异性引物序列分别如SEQ ID NO.1‑6、SEQ ID NO.7‑12所示，三个单重PCR检测体系的特异性引物序列分别如SEQ ID NO.13‑18所示。本发明专利技术的试剂盒能够对华北地区棉花蚜虫及其8种寄生蜂实现准确检测，片段大小皆在500bp以内，检出限达1000拷贝，灵敏度高、特异性强，耗时短、简便快速，结合单一PCR检测技术，可获得9‑10个物种的信息，在保证检测信息准确性和完整性的同时，快速建立蚜虫‑寄生蜂食物网关系，应用前景良好。

Cotton aphid and its parasitoid detection kit in North China

The invention provides a detection kit for cotton aphids and their parasitoids in North China. The kit includes two multiple PCR and three single PCR detection systems, and the specific primer sequences used in two multiple PCR detection systems, such as SEQ ID NO.1 6, SEQ ID NO.7 12, respectively, and the specific primer sequences of three mono PCR detection systems, respectively, as shown in SEQ ID 18. The kit can accurately detect the cotton aphid and its 8 parasitic wasps in North China. The size of the fragment is within 500bp, the detection limit is 1000 copies, the sensitivity is high, the specificity is strong, the time is short, and the information of the 10 species can be obtained with the single PCR detection technique, and the detection information is guaranteed. At the same time, the relationship between food web and aphid parasitic wasps can be established quickly.

【技术实现步骤摘要】
华北地区棉花蚜虫及其寄生蜂检测试剂盒
本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及检测华北地区小麦蚜虫及其寄生蜂的试剂盒及其应用。
技术介绍
棉蚜(AphisgossypiiGlover)是华北棉田主要蚜虫种类，它通过取食韧皮部汁液，在棉花生长初期对棉田造成严重危害。杀虫剂的滥用，使棉蚜产生抗药性，在适宜其生长的环境条件下，高密度的棉蚜会使影响棉花质量大幅降低产量。因此棉蚜的防治工作应受到足够的重视，而天敌在对棉蚜种群的控制中起到至关重要的作用。棉蚜寄生蜂作为棉蚜的重要寄生性天敌，值得我们深入研究。而目前对棉田寄生蜂控制作用的研究，仅局限于棉田僵蚜数量、僵蚜率的调查和僵蚜样品的采集。寄生蜂通过饲养出蜂到形态鉴定，不仅费时费力，而且会因为形态特征的微小模糊而很难鉴定到具体物种。为了准确评估棉田寄生蜂发生动态及其对蚜虫的控制作用，需要建立一套快速准确的分子检测方法，但目前未有针对棉田蚜虫和寄生蜂的系统性标准检测方法。本专利技术提供了一种高效便捷的分子检测方法，利用多重PCR检测技术灵敏度高、特异性强等特点，在同一反应中，同时检测多个物种，根据电泳条带大小区分不同物种，解决了棉蚜寄生蜂形态鉴定工作的制约问题，为准确鉴定物种和评估寄生蜂对蚜虫的控制作用提供有效手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测华北地区棉花蚜虫及其寄生蜂检测试剂盒，以实现对华北地区棉花蚜虫及其寄生蜂的快速检测，为准确鉴定物种和评估寄生蜂对蚜虫的控制作用提供有效帮助。为实现上述目的，根据线粒体DNA序列，设计筛选得到9对分别针对华北地区棉花蚜虫及其寄生蜂特异性引物，如表1。除一般的引物设计原则外，根据以下标准筛选引物：(1)扩增产物大小在100bp-500bp之间；(2)多重PCR检测体系结果中，不同扩增产物大小相差5bp以上。表1引物序列信息由此，本专利技术首先提供了一种检测华北地区棉花蚜虫(AphisgossypiiGlover)的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.13-14所示。含有核苷酸序列如SEQIDNO.13-14所示的特异性引物对的试剂盒属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供一种检测华北地区棉花蚜虫及其寄生蜂的特异性引物对组合，含有以下引物对：用于检测华北地区棉花蚜虫的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO.13-14所示；用于检测烟蚜茧蜂【Aphidiusgifuensis(Ashmead)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示；用于检测白足蚜小蜂【AphelinusalbipodusHayatandFatima】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.3-4所示；用于检测棉刺蚜茧蜂【Binodoxyscommunis(Gahan)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.5-6所示；用于检测的宽肩阿莎金小蜂Asaphessuspensus(Nees)和蚜茧蜂金小蜂AsaphesvulgarisWalker(二者均属于脊柄金小蜂属)通用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.7-8所示；用于检测蚜虫宽缘金小蜂【Pachyneuronaphidis(Bouché)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.9-10所示；用于检测Phaenoglyphisvillosa(Hartig)的特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.11-12所示；用于检测合沟细蜂Dendroceruscarpenteri(Curtis)的特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.15-16所示；用于检测黄足分盾细蜂Dendroceruslaticeps(Hedicke)的特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.17-18所示。本专利技术提供了上述特异性引物对组合在检测华北地区棉花蚜虫及其寄生蜂中的应用。进一步地，本专利技术提供一种检测试剂盒，含有上述9对特异性引物对组合，且所述特异性引物对组合构成2个多重PCR检测体系和3个单重PCR检测体系，其中，第1个多重PCR检测体系所用的特异性引物序列如SEQIDNO.1-6所示；第2个多重PCR检测体系所用的特异性引物序列如SEQIDNO.7-12所示；3个单重PCR检测体系所用的特异性引物序列分别如SEQIDNO.13-18所示。本专利技术的试剂盒还包括MultiplexMasterMix，ddH2O，牛血清蛋白溶液、四甲基氯化铵、标准阳性模板。进一步地，本专利技术试剂盒的工作程序包括以下步骤：(1)提取待测样品的核酸；(2)以步骤(1)的核酸为模板，分别进行2个多重PCR和3个单重PCR；(3)分析PCR产物；第1个多重PCR检测体系中：若PCR产物片段为156bp，则为烟蚜茧蜂；若PCR产物片段为224bp，则为白足蚜小蜂；若PCR产物片段为374bp，则为棉刺蚜茧蜂；第2个多重PCR检测体系中：若PCR产物片段为173bp，则为脊柄金小蜂属；若PCR产物片段为328bp，则为蚜虫宽缘金小蜂；若PCR产物片段为413bp，则为Phaenoglyphisvillosa；3个单重PCR检测体系中：若PCR产物片段为182bp，则为棉蚜；若PCR产物片段为100bp，则为合沟细蜂；若PCR产物片段为137bp，则为黄足分盾细蜂。上述多重PCR反应，其工作体系为：MP1为第1个多重PCR，MP2为第2个多重PCR。本专利技术试剂盒中，3个单重PCR体系试剂组分皆为ddH2O，1.5μL；2×MultiplexPCRMasterMix，5.0μL；10μM的上下游引物各1.0μL，DNA模板，1.5μL。PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，退火温度退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃后延伸10分钟；各体系退火温度为：MP1-MP2分别为第1-2个多重PCR；SP1-SP3分别为第1-3个单重PCR。本专利技术提供了所述的试剂盒在检测华北地区棉花蚜虫及其寄生蜂中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术根据GenBank中公布的基因序列(AccessionNo.见下表2)，设计一系列特异性引物，而这些引物仅对目标物种有扩增效果，对棉田其它蚜虫和寄生蜂无扩增能力，产物片段大小和灵敏度DNA浓度检出限见表2。表2目标物种对应GenBank序列号、片段大小及DNA浓度检出限本专利技术在棉花蚜虫、寄生蜂检测方面具有很高的价值，通过两次多重PCR和三次单重PCR可获得16-17种物种信息，具有简便、准确性高、特异性强的特点，特别是在检测大量样品时，大大缩短检测时间和降低人力，提高检测效率。附图说明图1为本专利技术实例1中SP1目标物种特异性引物在各蚜虫，寄生蜂物种中的检测结果；其中1,2阴性对照,3,4华北地区棉蚜,5,6棉黑蚜,7,8棉长管蚜,9,10麦无网长管蚜,11,12麦长管蚜,13,14麦二叉蚜,15,16禾谷缢管蚜,17,18白足蚜小蜂,19,20棉蚜刺茧蜂,21,22烟蚜茧蜂,23,24有须蚜外茧蜂,25,26豆柄瘤蚜茧蜂,27,28亚洲三叉蚜茧蜂,29,30翼蚜外蚜茧蜂,31,32乌兹别克蚜茧蜂,33,34阿尔蚜茧蜂,35,36宽肩阿莎金小蜂,37,38蚜茧蜂金小蜂,39,40蚜虫宽缘金小蜂,41,42Phaenoglyphisvillosa,43,44Alloxyst本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测华北地区棉花蚜虫(Aphis gossypii Glover)的特异性引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13‑14所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测华北地区棉花蚜虫(AphisgossypiiGlover)的特异性引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.13-14所示。2.含有权利要求1所述的特异性引物对的试剂盒。3.一种检测华北地区棉花蚜虫及其寄生蜂的特异性引物对组合，其特征在于，含有以下引物对：用于检测华北地区棉花蚜虫的特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO.13-14所示；用于检测烟蚜茧蜂【Aphidiusgifuensis(Ashmead)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示；用于检测白足蚜小蜂【AphelinusalbipodusHayatandFatima】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.3-4所示；用于检测棉刺蚜茧蜂【Binodoxyscommunis(Gahan)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.5-6所示；用于检测的宽肩阿莎金小蜂Asaphessuspensus(Nees)和蚜茧蜂金小蜂AsaphesvulgarisWalker通用引物的核苷酸序列如SEQIDNO.7-8所示；用于检测蚜虫宽缘金小蜂【Pachyneuronaphidis(Bouché)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.9-10所示；用于检测Phaenoglyphisvillosa(Hartig)的特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.11-12所示；用于检测合沟细蜂Dendroceruscarpenteri(Curtis)的特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.15-16所示；用于检测黄足分盾细蜂Dendroceruslaticeps(Hedicke)的特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.17-18所示。4.一种检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的特异性引物对组合，且所述特异性引物对组合构成2个多重PCR检测体系和3个单重PCR检测体系，其中，第1个多重PCR检测体系所用的特异性引物序列如SEQIDNO.1-6所示；第2个多重PCR检测体系所用的特异性引物序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆宴辉，杨帆，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11