肉制品中绵羊和山羊源性同步检测的引物和探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种肉制品中绵羊和山羊源性同步检测的引物和探针及试剂盒，引物和探针序列如下：两源性检测正向引物序列如SEQ ID No.1所示；绵羊源性检测反向引物序列如SEQ ID No.2所示；山羊源性检测反向引物序列如SEQ ID No.3所示；绵羊探针序列如SEQ ID No.4所示；山羊探针序列如SEQ ID No.5所示；质控探针序列如SEQ ID No.6所示。本发明专利技术的引物、探针及试剂盒的特异性好、灵敏度高，可以实现肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测，并且可以进行绵羊源性和山羊源性的定量检测。

Primers, probes and kits for simultaneous detection of sheep and goat origin in meat products

The present invention discloses a primer and a probe and a kit for synchronous detection of sheep and goats in meat products. The primers and probe sequences are as follows: two source detection positive primer sequences, such as SEQ ID No.1, as shown in the sheep origin detection reverse primer sequence, such as SEQ ID No.2, and the reverse primer sequence of goat origin detection, such as SEQ ID. No. 3; sheep probe sequence as SEQ ID No. 4; goat probe sequence as SEQ ID No. 5; quality control probe sequence as SEQ ID No. 6. The primers, probes and kits of the invention have good specificity and high sensitivity, and can realize sheep origin, goat origin and quality control and same tube detection in meat products, and can be used for quantitative detection of sheep origin and goat origin.

【技术实现步骤摘要】
肉制品中绵羊和山羊源性同步检测的引物和探针及试剂盒
本专利技术属于食品检测
，尤其涉及肉制品中动物源性检测领域。
技术介绍
羊肉是消费者广泛食用的家畜肉之一。羊肉不仅营养丰富、肉质细嫩、容易消化，还具有高蛋白、低脂肪、含磷脂多、胆固醇少的特点。然而，伴随着日益增长的生产量和消费量，肉制品成为在食品生产、加工、流通以及餐饮领域中造假掺假的主要目标。目前，肉制品真伪鉴别相关的技术研究、检测标准、专利技术专利以及商业试剂盒主要集中在单一通道单一源性检测和异管质控检测，同时多通道多源性检测和同管质控检测报道较少。假阴性一直是困扰PCR技术在肉制品真伪鉴别中广泛应用的瓶颈。同管质控是去除假阴性的有效手段。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为：如何提供一种高效且特异性强的肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的引物、探针及试剂盒和方法，解决肉制品中绵羊和山羊源性成分定性和定量检测问题。本专利技术的技术方案为：肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的引物和探针，引物和探针序列如下：两源性检测正向引物序列如SEQIDNo.1所示；绵羊源性检测反向引物序列如SEQIDNo.2所示；山羊源性检测反向引物序列如SEQIDNo.3所示；绵羊探针序列如SEQIDNo.4所示；山羊探针序列如SEQIDNo.5所示；质控探针序列如SEQIDNo.6所示。进一步地，绵羊探针、山羊探针和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，淬灭基团为TAMRA、BHQ1或BHQ2中任意一种。作为本专利技术的另一目的，提供了一种肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：SEQIDNo.1所示的两源性检测正向引物，SEQIDNo.2所示的绵羊源性检测反向引物，SEQIDNo.3所示的山羊源性检测反向引物，SEQIDNo.4所示的绵羊探针，SEQIDNo.5所示的山羊探针，SEQIDNo.6所示的质控探针，ProbeqPCR预混液，绵羊阳性标准品，山羊阳性标准品。当然，也可以单独检测绵羊源性，为了节省成本，只需要去除山羊源性相关的试剂即可(SEQIDNo.3所示的山羊源性检测反向引物、SEQIDNo.5所示的山羊探针和山羊阳性标准品)因此，作为本专利技术的另一目的，还提供了一种肉制品中绵羊源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：SEQIDNo.1所示的两源性检测正向引物，SEQIDNo.2所示的绵羊源性检测反向引物，SEQIDNo.4所示的绵羊探针，SEQIDNo.6所示的质控探针，ProbeqPCR预混液，绵羊阳性标准品。当然，也可以单独检测山羊源性，为了节省成本，只需要去除绵羊源性相关的试剂即可(SEQIDNo.2所示的绵羊源性检测反向引物、SEQIDNo.4所示的绵羊探针和绵羊阳性标准品)因此，作为本专利技术的另一目的，还提供了一种肉制品中山羊源性以及质控同管检测的试剂盒，该试剂盒中含有：SEQIDNo.1所示的两源性检测正向引物，SEQIDNo.3所示的山羊源性检测反向引物，SEQIDNo.5所示的山羊探针，SEQIDNo.6所示的质控探针，ProbeqPCR预混液，山羊阳性标准品。肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的方法，步骤如下：(1)提取肉制品的DNA；(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100-200ng/μL；(3)利用SEQIDNo.1～SEQIDNo.6的引物和探针对稀释DNA进行多重荧光定量PCR扩增，利用绵羊和山羊阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；(4)Real-timePCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取绵羊、山羊和质控相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当质控Ct≤35和阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应两源性；(5)利用绵羊和山羊阳性标准品做DNA定量的标准曲线；(6)利用检测肉制品的相应源性的Ct值和标准曲线中的公式可以得到肉制品中相应源性的定量检测结果。进一步地，Real-timePCR扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，31s，40循环。进一步地，Real-timePCR反应体系为：ProbeqPCR预混液10μL、SEQIDNo.1所示的两源性检测正向引物1μL，浓度为10μmol/L；SEQIDNo.2所示的绵羊源性检测反向引物0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQIDNo.3所示的山羊源性检测反向引物0.5μL，浓度为10μmol/L；SEQIDNo.4所示的绵羊探针1μL，浓度为10μmol/L；、SEQIDNo.5所示的山羊探针1μL，浓度为10μmol/L和SEQIDNo.6所示的质控探针1μL，浓度为10μmol/L；DNA模板1μL，灭菌的去离子水4μL，总体积20μL。本专利技术通过比对绵羊、山羊、牛、马、猪、鸡、鸭、鹅、狗、兔、猫及鱼等12种动物的线粒体基因组，每种动物选取10个品种或品系的线粒体基因组序列。通过生物信息软件比对上述120条序列，筛选出绵羊和山羊保守和特异的序列，利用引物设计软件进行引物和探针的设计。设计的创新性在于需要在100-150bp的序列上筛选出两端保守和中间特异的序列，两端保守的位置设计引物，中间特异的位置设计探针。保守的引物和特异的探针可以有效的减少引物之间的错配以及多个PCR反应对反应资源的竞争，可以保证多重实时荧光定量PCR反应的进行。多重实时荧光定量PCR反应是多源性成分检测的基础。引物和探针的退火温度控制在55-60℃和65-70℃，并且没有影响退火效率的二级结构，而且要保证引物和探针在线粒体基因上具有高度的特异性，上述设计保证引物和探针可以用于后续的定性和定量检测。本专利技术研发了绵羊、山羊及质控等3通道检测引物和探针，优化多通道多源性检测和同管质控检测的引物和探针组合。在此过程中克服了同一PCR反应体系中多种引物和探针之间的影响以及对模板以及PCR反应资源的竞争的问题，达到PCR反应体系可以同时进行多重实时荧光PCR的效果。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的引物、探针及试剂盒的特异性强、灵敏度高，可以实现肉制品中绵羊和山羊源性的定性和定量检测，并且可以进行绵羊、山羊和质控的同时检测，节省了工序，降低了成本。附图说明图1利用FAM和TAMRA修饰探针标记绵羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记山羊源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对对绵羊、牛、马、猪、鸡、鸭、鹅、狗、兔、猫及鱼等11种动物肌肉组织(其它肉)进行的实时荧光定量PCR的检测，绵羊肉中出现扩增曲线，其它肉都没有出现扩增曲线，说明绵羊源性引物和探针具有特异性。图2利用FAM和TAMRA修饰探针标记绵羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记山羊源性及ROX和BHQ2修饰探针标记质控对照对对山羊、牛、马、猪、鸡、鸭、鹅、狗、兔、猫及鱼等11种动物肌肉组织(其它肉)进行的实时荧光定量P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的引物和探针，其特征在于，引物和探针序列如下：两源性检测正向引物序列如SEQ ID No.1所示，绵羊源性检测反向引物序列如SEQ ID No.2所示，山羊源性检测反向引物序列如SEQ ID No.3所示，绵羊探针序列如SEQ ID No.4所示，山羊探针序列如SEQ ID No.5所示，质控探针序列如SEQ ID No.6所示。

【技术特征摘要】
1.肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的引物和探针，其特征在于，引物和探针序列如下：两源性检测正向引物序列如SEQIDNo.1所示，绵羊源性检测反向引物序列如SEQIDNo.2所示，山羊源性检测反向引物序列如SEQIDNo.3所示，绵羊探针序列如SEQIDNo.4所示，山羊探针序列如SEQIDNo.5所示，质控探针序列如SEQIDNo.6所示。2.根据权利要求1所述的肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的引物和探针，其特征在于，绵羊探针、山羊探针和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，淬灭基团为TAMRA、BHQ1或BHQ2中任意一种。3.肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：SEQIDNo.1所示的两源性检测正向引物，SEQIDNo.2所示的绵羊源性检测反向引物，SEQIDNo.3所示的山羊源性检测反向引物，SEQIDNo.4所示的绵羊探针，SEQIDNo.5所示的山羊探针，SEQIDNo.6所示的质控探针，ProbeqPCR预混液，绵羊阳性标准品，山羊阳性标准品。4.肉制品中绵羊源性以及质控同管检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：SEQIDNo.1所示的两源性检测正向引物，SEQIDNo.2所示的绵羊源性检测反向引物，SEQIDNo.4所示的绵羊探针，SEQIDNo.6所示的质控探针，ProbeqPCR预混液，绵羊阳性标准品。5.肉制品中山羊源性以及质控同管检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：SEQIDNo.1所示的两源性检测正向引物，SEQIDNo.3所示的山羊源性检测反向引物，SEQIDNo.5所示的山羊探针，SEQIDNo.6所示的质控探针，ProbeqPCR预混液，山羊阳性标准品。6.肉制品中绵羊源性、山羊源性以及质控同管检测的方法，其特征在于，步骤如下：(1)提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭梁，徐伟良，李春冬，海小，郭元晟，朱建军，雅梅，钱俊平，孙建萍，
申请(专利权)人：锡林郭勒职业学院，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15