一种用于检测肺孢子虫的引物、探针和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测肺孢子虫的引物、探针和试剂盒，属于生物技术领域。所述引物和探针包括：用于检测肺孢子虫的正向引物、用于检测肺孢子虫的反向引物和用于检测肺孢子虫的探针。所述试剂盒包括所述的引物和探针。本发明专利技术实施例提供的用于检测肺孢子虫的引物和探针，具有灵敏度高的特性，使得本发明专利技术实施例提供的用于检测肺孢子虫的试剂盒，针对检测肺孢子虫具有灵敏度高的特性；检测速度快，整个检测过程共仅需2～3小时。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种用于检测肺孢子虫的引物、探针和试剂盒。
技术介绍
肺孢子虫(Pneumocystis)是一种呈世界性分布的机会致病性病原体，肺孢子虫最早发现于豚鼠体内。肺孢子虫作为致病性病原体，可以引起严重的肺部疾患称肺孢子虫肺炎(Pnuemocystis Pneumonia，PCP)。现有技术中常采用环介导恒温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测肺孢子虫，环介导恒温扩增是一种新的核酸扩增方法，采用环介导恒温扩增法检测肺孢子虫的过程，试剂容易被污染，因此，在操作时需要非常规范，即便规范操作有时也可能会引起污染，大大降低了检测的成功率。
技术实现思路
为了解决现有技术中检测肺孢子虫成功率低的问题，本专利技术实施例提供了一种用于检测肺孢子虫的引物、探针和试剂盒。所述技术方案如下：一方面，本专利技术实施例提供了一种用于检测肺孢子虫的引物和探针，所述引物和探针包括：用于检测肺孢子虫的正向引物、用于检测肺孢子虫的反向引物和用于检测肺孢子虫的探针，其中，所述用于检测肺孢子虫的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述用于检测肺孢子虫的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；所述用于检测肺孢子虫的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。另一方面，本专利技术实施例提供了一种用于检测肺孢子虫的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和探针。具体地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。具体地，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为0.03-0.3％的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0.04-0.4％的壬基酚聚氧乙烯(40)醚和pH值为8.3的终浓度为0.01-0.1M的三(羟甲基)氨基甲烷。具体地，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL的Taq酶、终浓度为0.2～0.6mM的dNTPs、10×PCR缓冲液和终浓度为1.5～5.0mM的含Mg离子的溶液。具体地，所述临界阳性质控品包括含浓度为1.0×104拷贝/mL的肺孢子虫基因片段的溶液。具体地，所述引物的终浓度为0.05-0.9μM，所述探针的终浓度为0.05-0.9μM。具体地，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作标准品4，其中，所述工作标准品1为含有1.0×107拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段；所述工作标准品2为含有1.0×106拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段；所述工作标准品3为含有1.0×105拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段；所述工作标准品4为含有1.0×104拷贝/mL的肺孢子虫基因的非传染性DNA片段。具体地，，所述阳性质控品包括含浓度为1.0×106拷贝/mL的肺孢子虫基因片段的溶液。具体地，所述阴性质控品为浓度0.8％生理盐水。本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本专利技术实施例提供的用于检测肺孢子虫的引物和探针，具有灵敏度高的特性，使得本专利技术实施例提供的用于检测肺孢子虫的试剂盒，具有灵敏度高的特性，采用仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，其检测结果可靠，提高了检测的灵敏度，即使仅存在单拷贝的目的片段该试剂盒也可以进行有效的检测；检测速度快，整个检测过程共仅需2～3小时。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例2提供的荧光扩增曲线图；图2是本专利技术实施例3提供的荧光扩增曲线图；图3是本专利技术实施例4提供的荧光扩增曲线图；图4是本专利技术实施例5提供的标准曲线的荧光扩增曲线图；图5是本专利技术实施例5提供的荧光扩增曲线图；图6是本专利技术实施例5提供的由图4得到的标准曲线图，图6横坐标为Log Starting Quantity copy number，纵坐标为Threshold Cycle。图中：Cycles为循环数，RFU为荧光值，Log Starting Quantity copy number为肺孢子虫起始浓度的对数值，Ct(Threshold Cycle)值为循环数；1a-实施例2中样品1，4a-实施例2中样品4，5a-实施例2中样品5，6a-实施例2中样品6，7a-实施例2中样品7。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本专利技术实施方式作进一步地详细描述。以下实施例中所用试剂和探针主要购自宝生物工程(大连)有限公司。实施例1.一种用于肺孢子虫核酸定量检测的引物和荧光探针本专利技术实施例提供了一种用于检测肺孢子虫的引物和探针，引物和探针包括：用于检测肺孢子虫的正向引物、用于检测肺孢子虫的反向引物和用于检测肺孢子虫的探针，其中，用于检测肺孢子虫的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；用于检测肺孢子虫的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示用于检测肺孢子虫的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。在本专利技术实施例中，探针的荧光报告基团为FAM，FAM的激发波长为485nm，接收波长为527nm；淬灭基团为Eclipse。纯化方式可选自：HAP、PAGE和HPLC纯化方式，具体地引物和探针如下表：表1.肺孢子虫引物和探针表1中：F：forward，正向；肺孢子虫-F表示肺孢子虫的正向引物。R：reverse，反向；肺孢子虫-R表示肺孢子虫的反向引物。P：probe，荧光探针(探针)；肺孢子虫-P表示肺孢子虫荧光探针，荧光探针可以为TaqMan-MGB荧光探针、LNA荧光探针或MGB荧光探针。表1的设计的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测肺孢子虫的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：用于检测肺孢子虫的正向引物、用于检测肺孢子虫的反向引物和用于检测肺孢子虫的探针，其中，所述用于检测肺孢子虫的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述用于检测肺孢子虫的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；所述用于检测肺孢子虫的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测肺孢子虫的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包
括：用于检测肺孢子虫的正向引物、用于检测肺孢子虫的反向引物和用于检测
肺孢子虫的探针，其中，
所述用于检测肺孢子虫的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；
所述用于检测肺孢子虫的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；
所述用于检测肺孢子虫的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；
所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、
Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、
BHQ3或DABCYL。
2.一种用于检测肺孢子虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利
要求1所述的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸
释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准
品。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括无菌
水、终浓度为0.03-0.3％的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0.04-0.4％的壬基酚聚
氧乙烯(40)醚和pH值为8.3的终浓度为0.01-0.1M的三(羟甲基)氨基甲烷。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液各组分在
PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0....

【专利技术属性】
技术研发人员：刘茹，桑筱筱，
申请(专利权)人：湖北永邦医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42