一种熊蜂孢子虫的PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种熊蜂孢子虫的PCR检测方法，属于生物技术领域。所述PCR反应体系中有一对特异性引物Api-F和Api-R，上述引物能够从感染熊蜂孢子虫的熊蜂DNA中特异性扩增一段316 bp的片段，从而实现对熊蜂孢子虫的PCR检测。本发明专利技术的熊蜂孢子虫PCR检测方法，对全基因合成的熊蜂孢子虫DNA的检测灵敏度可达到1.39 fg/μL，具有特异性强，稳定性好，快速准确的特点，可用于进境熊蜂和国内养殖熊蜂体内熊蜂孢子虫的检测，为防止熊蜂孢子虫的传入和国内熊蜂孢子虫病的防控提供可靠的理论和技术依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体设及一种熊蜂抱子虫的PCR检测方法。
技术介绍
1日3；1〇1'1(1日）、抱子虫属(49；[。731:13)。熊蜂抱子虫是一 种寄生于熊蜂属和西方蜜蜂的原生动物寄生虫，外形与熊蜂微抱子虫类似但较大，抱子呈 船型，大小约11.4-14.4皿长，3.6-5.4皿宽。自在芬兰和意大利出现后，运种寄生虫很快 传染到欧洲各国，目前国内尚没有熊蜂抱子虫的报道，但运种寄生虫致病力强，如不严格预 防，随着商用熊蜂群进出口贸易往来的加大，将对我国熊蜂的饲养和繁育产生巨大影响。 熊蜂抱子虫的检验主要是解剖观察和镜检观察，镜检观察主要是取病蜂的脂肪体 和中肠组织涂片在甲醇中固定2分钟，0.25%吉姆萨染色8-12小时后，于光学显微镜下观 察。镜检观察容易漏检，且易与微抱子虫病、短膜虫病等混淆。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种熊蜂抱子虫的PCR检测方法，W便准确、灵敏、快速、经 济地检测进口熊蜂及国内养殖熊蜂蜂群中的熊蜂抱子虫。[000引本专利技术提供的熊蜂抱子虫的PCR检测方法，具体步骤如下： 利用特异性引物对，对疑似感染熊蜂抱子虫的熊蜂腹部组织DNA进行PCR扩增，扩增产 物进行凝胶电泳检测，如扩增出316 bp的熊蜂抱子虫基因片段，则标志着待检测样品为熊 蜂抱子虫阳性。其中，所述特异性引物对为： 上游引物Api-F: 5 ' -AGCGATGGATGTCTTGGG-3 ' ； 下游引物Ap i -R: 5 ' -TTCAGCGGGTAACCTTGT-3 '。 其中，所述PCR的反应体系如下：反应体系总体积为20 yL。[000引其中，所述PCR的反应条件为:95°C预变性4 min后进入循环，95°C变性1 min，56 °(3退火1111111，72°(3延伸1111111，40个循环，最后72°(3延伸10111111。 其中，所述凝胶电泳为1.5 %琼脂糖凝胶电泳。 本专利技术还提供用于熊蜂抱子虫的PCR检测方法的特异性引物对，上游引物为上游 引物 Api-F:5'-AGCGATGGATGTCTTGGG-3' ；下游引物为Api-R:5'-TTCAGCGGGTAACCTTGT-3'。 本专利技术还提供所述熊蜂抱子虫的PCR检测方法在进境熊蜂及国内养殖蜂群中的应 用。[001引本专利技术的优点在于:本专利技术所提供的熊蜂抱子虫的PCR检测方法能快速、准确、灵 敏地检测熊蜂抱子虫。所述PCR反应体系中有一对特异性引物Api-F和Api-R，上述引物能够 从感染熊蜂抱子虫的熊蜂DNA中特异性扩增一段316 bp的片段，从而实现对熊蜂抱子虫的 PCR检测。本专利技术的熊蜂抱子虫PCR检测方法，对全基因合成的熊蜂抱子虫DNA的检测灵敏度 可达到1.39 fg/yL，具有特异性强，稳定性好，快速准确的特点，可用于进境熊蜂和国内养 殖熊蜂体内熊蜂抱子虫的检测，为防止熊蜂抱子虫的传入和国内熊蜂抱子虫病的防控提供 可靠的理论和技术依据。【附图说明】 图1为本专利技术实施例1易和熊蜂抱子虫混淆的病虫害DNA的PCR产物琼脂糖凝胶 电泳图。其中Μ :DNAMarker I;N :阴性对照(d地2〇);1:熊蜂抱子虫;2:熊蜂微抱子虫；3: 东方蜜蜂微抱子虫，4:西方蜜蜂微抱子虫，5:熊蜂短膜虫;6:布赫纳幢蛾。 图2为本专利技术实施例2为全基因合成的熊蜂抱子虫DNA不同稀释倍数下的PCR产物 的琼脂糖凝胶电泳图。其中Μ :DNAMarker I;N:阴性对照（d地2〇); 1:阳性对照；2 :1〇d;3 :1〇1 ;4 :102;5 :103;6 :104;7 :105;8 :1〇6 ;9 :1〇7;10 :1〇8;11 :109;12 :l〇w;13 : 1〇11 ;14 :1〇i2;15 :1〇i3;16 :1〇i4;17 :1〇1 己。[001引图3为本专利技术实施例3利用本专利技术检测方法对23份临床样本的检测。其中Μ :DNA Marker I ;N :阴性对照(dd出0):1-23分别表示23份待检样本。【具体实施方式】 W下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。 实施例1熊蜂抱子虫的特异性检验 采用本专利技术方法，对扩增测序为熊蜂抱子虫阳性的DNA样本和其他寄生病虫害进行熊 蜂抱子虫的检验。 特异性引物对为： Api-F:5 '-AGCGATGGATGTCTTGGG-3 '； Api-R:5'-TTCAGCGGGTAACCTTGT-3'。 PCR反应体系中包括4 化的5XGoTaq Buffer、1.5 化的MgCb (25mM)(Promega 公司），2.0 化的dNTPs(200yM)(TaKaRa 公司），引物Api-F、引物Api-R 各 1 μΚ?0μΜ)，0.5 化的GoTaq? DM聚合酶，2化的模板DNA，d地2〇补足至20化： 反应条件为95°C预变性4 min后进入循环，95°C变性1 min，56°C退火1 min，72°C延伸 1 min,40个循环，最后72°C延伸10 min。 取6化扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果见图1中PCR产物的琼 脂糖凝胶电泳条带。熊蜂抱子虫阳性样本用引物Api-F/Api-R进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检 测结果表明扩增出了316 bp的熊蜂抱子虫基因片段，其他寄生病虫害DNA用引物Api-F/ Api-R扩增产物的1.5%琼脂糖凝胶电泳未检测出电泳条带，使用本专利技术的方法可用于疑似 感染熊蜂抱子虫的熊蜂检验。 实施例2熊蜂抱子虫的灵敏性检验 采用本专利技术方法，对全基因合成的熊蜂抱子虫DNA不同稀释倍数进行灵敏度检验。 [002引PCR反应方法、体系与条件均同实例1，PCR扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳 检测，图2为全基因合成的熊蜂抱子虫DNA10^^-10l5倍稀释后PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条 带。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现108倍稀释的139 ng/化模板DNA扩增出了 条带，本专利技术中的特异性引物对Api-F/Api-R的灵敏度为1.39 fg/ yL。实施例3熊蜂抱子虫的临床样本检测 提取待检测熊蜂的腹部组织基因组DNA 剪取熊蜂腹部组织置于研鉢，加入适量液氮快速研磨，反复几次研磨成浆，用CTAB法提 取熊蜂腹部组织基因组DNA，具体步骤如下： 熊蜂腹部组织研磨成浆后转移至1.5 mL离屯、管中，12000巧m离屯、2 min,弃上清，加入 50化TE缓冲液，使样品充分悬浮后，加入60化10% SDS溶液和10化20 mg/mL的蛋白 酶K，混匀后于37°C下溫育1 h; 加入100 μL 5 mol/L的NaCl溶液，上下颠倒充分混匀，加入80化CTAB/NaCl溶液， 混匀后65°C溫育10 min; 加入700 μL氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，混匀后12000巧m离屯、2 min;吸取上清 至另一干净离屯、管，加入等体积的酪/氯仿/异戊醇（Ξ者体积比为25: 24:1)，上下颠倒混 匀，12000 rpm离屯、2 min;再次吸取上清至另一干净离屯、管，加入2倍体积预冷的无水乙 醇沉淀DNA，轻轻混匀，4°C下12000巧m离屯、30 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测熊蜂孢子虫的PCR引物，其特征在于：所述的特异性引物对为：上游引物Api‑F：5’‑AGCGATGGATGTCTTGGG‑3’；下游引物Api‑R：5’‑TTCAGCGGGTAACCTTGT‑3’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张体银，刘蓓，郑腾，白泉阳，王武军，张志灯，于师宇，林素洁，
申请(专利权)人：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：福建;35