一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的PCR检测方法技术

本发明专利技术涉及一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的PCR检测方法。提取水产养殖动物组织的总DNA；以所提取的DNA为模板，采用副溶血弧菌特异性引物，进行PCR扩增；所述的副溶血弧菌特异性引物是针对副溶血弧菌的recB基因的特异性引物P1或pyrH基因的特异性引物P2；根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断水产养殖动物是否被副溶血弧菌感染。本发明专利技术，使得水产养殖动物体内残留副溶血弧菌的检测更为简便，为今后水产养殖动物体内残留副溶血弧菌检测和分析提供了必要的理论依据和完善的方法体系，同时为我国水产品病原菌检测和我国食品进出口安全奠定基础。

PCR detection method for Vibrio parahaemolyticus in aquiculture animals

The invention relates to a PCR detecting method for Vibrio parahaemolyticus in aquiculture animals. Total DNA was extracted from the tissue of aquatic animal; with the extracted DNA as template, using Vibrio parahaemolyticus specific primers for PCR amplification primer specificity; Vibrio parahaemolyticus is the specific primers of P1 or pyrH gene targeting the recB gene of Vibrio parahaemolyticus by primer P2; according to the agarose gel PCR amplification was like the judgment of aquaculture animal is infected with Vibrio parahaemolyticus. The present invention, the detection of aquatic animal residues of Vibrio parahaemolyticus is more convenient, to provide the necessary theoretical basis and way to improve the system for future aquaculture residues in animal Vibrio parahaemolyticus detection and analysis, at the same time for the detection of pathogenic bacteria and aquatic products in China China's food import and export security foundation.

【技术实现步骤摘要】
一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的PCR检测方法
本专利技术属于病原微生物检测领域，具体的涉及一种养殖水产动物中常见的病原菌：副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)的PCR检测方法。
技术介绍
副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)，是一种主要的食源性致病菌，嗜盐的革兰氏阴性细菌，属弧菌科弧菌属，广泛分布于沿海、河口环境和鱼、虾、贝等海产品中。同时副溶血弧菌是一种引起食源性疾病的重要病原菌，可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。研究数据表明，50％～70％因食用海产品引发的腹泻病例是由副溶血弧菌引起的。目前国内外对副溶血弧菌检测方法主要有细菌生化方法、免疫学检测方法、环介导恒温扩增技术、分析化学方法、分子生物检测法。但存在着检测方法复杂，灵敏性差等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种水产养殖动物体内残留副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)的PCR检测方法。本专利技术的方法可快速鉴定致病源，为我国水产品进出口安全提供技术支持。本专利技术采用的技术方案是：一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的PCR检测方法，方法如下：1)提取水产养殖动物组织的总DNA；2)以所提取的DNA为模板，采用副溶血弧菌特异性引物，进行PCR扩增；所述的副溶血弧菌特异性引物是针对副溶血弧菌的recB基因的特异性引物P1或pyrH基因的特异性引物P2；所述的特异性引物P1的上下游引物的序列是：P1-F:AGAAGAAGCGCCCGTTGAAG；P1-R:GCATGCAATCTGTGTGTCGG。所述的特异性引物P2的上下游引物的序列是：P1-F:AGTTATCGGTGGCGGTAACC；P1-R:GCCTGCTGAGAAGATTACAACG。PCR反应条件：第一阶段：94℃5min；第二阶段：94℃30s，61℃或62℃30s，72℃30s；30循环；第三阶段：72℃5min；第四阶段：4℃保存。3)根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断水产养殖动物是否被副溶血弧菌感染。判断标准为，针对特异性引物P1，如果PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果有212bp条带产生，则水产养殖动物被副溶血弧菌感染，否则没有被感染；针对特异性引物P2，如果PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果有253bp条带产生，则大菱鲆被副溶血弧菌感染，否则没有被感染。所述的水产养殖动物为大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾或三文鱼。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术，设计的副溶血弧菌特异性引物，能有效从各常见致病菌株中区分出副溶血弧菌，表现出很强的特异性。2.本专利技术，设计的副溶血弧菌特异性引物，灵敏性高，可有效检出养殖水产品动物体内残留的副溶血弧菌，其最低检测浓度可达到10-3ng/ul。3.本专利技术，所提供的水产养殖动物体内残留副溶血弧菌的PCR检测方法，使得水产养殖动物体内残留副溶血弧菌检测更为简便。在水产养殖动物中，一旦存在病原菌副溶血弧菌，即能够做到快速鉴定，为我国水产品进出口提供有效的检查方法。4.本专利技术的检测方法可有效检出水产养殖动物体内的高危致病菌副溶血弧菌，经验证此检测方法特异性强，灵敏度高。该检测方法的确立为今后水产养殖动物体内残留病原菌副溶血弧菌的检测和分析提供了必要的理论依据和完善的方法体系，不仅为我国水产品进出口食品安全提供技术支持，同时为我国养殖水产品食品安全健康发展做出了贡献。附图说明图1是实施例1副溶血弧菌特异性引物P1的PCR反应条件优化；其中，M:MarkerD，1-5:退火温度分别为58℃，59℃，60℃，61℃，62℃。图2是实施例1副溶血弧菌特异性引物P1的特异性验证；其中，1.Vibriovulnificus；2.Vibriohollisae；3.Vibrioparahemolyticus；4.Vibrioharveyi；5.Vibriogigantis；6.Vibriocampbellii；7.Vibrioalginolyticus；8.Vibriometschnikovii；9.Vibriomimicus；10.Vibriocyclitrophicus；11..Aeromonashydrophila；12.Aeromonassalmonicida；13.Aeromonassobria14.Aeromonasveronii15.Pseudomonashelmanticensis；16.Pseudomonasaeruginosa；17.Pseudomonaskilonensis，18.Bordetellatrematum；M:MarkerD。图3是实施例1副溶血弧菌特异性引物P1的PCR反应灵敏性验证。其中，M:MarkerD，1-7:模板浓度分别为101ng/ul，100ng/ul，10-1ng/ul，10-2ng/ul，10-3ng/ul，10-4ng/ul，10-5ng/ul。图4是实施例1副溶血弧菌特异性引物P1对不同水产养殖动物PCR扩增产物的凝胶成像结果；其中，M:MarkerD，1-7分别为注射0.1ml副溶血弧菌菌液的大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾、三文鱼组织；8-14分别为注射0.90％生理盐水的大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾、三文鱼组织。图5是实施例2副溶血弧菌特异性引物P2的PCR反应条件优化；其中，M:MarkerDL2000，1-5:退火温度分别为57℃，58℃，59℃，60℃，61℃。图6是实施例2副溶血弧菌特异性引物P2的特异性验证；其中，1.Vibriovulnificus；2.Vibrioparahemolyticus；3.Vibrioharveyi；4.Vibriofluvialis；5.Vibriocampbellii；6.Vibrioalginolyticus；7.Vibriometschnikovii；8.Vibriomimicus；9.Vibriogigantis；10.Aeromonashydrophila；11.Aeromonassalmonicida；12.Aeromonasveronii；13.Pseudomonashelmanticensis；14.Pseudomonasaeruginosa；15.Pseudomonaskilonensis；16.BordetellatrematumM:MarkerDL2000。图7是实施例2副溶血弧菌特异性引物P2的PCR反应灵敏性验证。其中，M:MarkerDL2000，1-7:模板浓度分别为101ng/ul，100ng/ul，10-1ng/ul，10-2ng/ul，10-3ng/ul，10-4ng/ul，10-5ng/ul。图8是实施例2副溶血弧菌特异性引物P2对大菱鲆人工感染副溶血弧菌PCR扩增产物的凝胶成像结果；其中，M:MarkerDL2000，1-7分别为注射0.1ml副溶血弧菌菌液的大菱鲆肌肉组织，8-14分别为注射0.90％生理盐水的大菱鲆肌肉组织。具体实施方式下面的实施例将对本专利技术予以进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例1(一)副溶血弧菌特异性引物的设计本实施例针对菌种副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的PCR检测方法，其特征在于，方法如下：1)提取水产养殖动物组织的总DNA；2)以所提取的DNA为模板，采用副溶血弧菌特异性引物，进行PCR扩增；所述的副溶血弧菌特异性引物是针对副溶血弧菌的recB基因的特异性引物P1或pyrH基因的特异性引物P2；3)根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断水产养殖动物是否被副溶血弧菌感染。

【技术特征摘要】
1.一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的PCR检测方法，其特征在于，方法如下：1)提取水产养殖动物组织的总DNA；2)以所提取的DNA为模板，采用副溶血弧菌特异性引物，进行PCR扩增；所述的副溶血弧菌特异性引物是针对副溶血弧菌的recB基因的特异性引物P1或pyrH基因的特异性引物P2；3)根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断水产养殖动物是否被副溶血弧菌感染。2.根据权利要求1所述的一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的PCR检测方法，其特征在于，所述的副溶血弧菌是Vibrioparahemolyticus。3.根据权利要求1所述的一种水产养殖动物体内副溶血弧菌的PCR检测方法，其特征在于，所述的特异性引物P1的上下游引物的序列是：P1-F:AGAAGAAGCGCCCGTTGAAGP1-R:GCATGCAATCTGTGTGTCGG所述的特异性引物P2的上下游引物的序列是：P1-F:AGTTATCGGTGGCGGTAACCP1-R...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宏生，张新刚，邹本尧，艾海新，
申请(专利权)人：辽宁大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21