原位杂交检测口腔肿瘤组织中长链非编码RNA LINC00472试剂的应用制造技术

本发明专利技术公开了原位杂交检测口腔肿瘤组织中长链非编码RNA LINC00472试剂的应用，即用于制备口腔肿瘤患者的预后制剂，特别是制备出原位杂交检测法预测口腔肿瘤患者预后的试剂盒。通过研究证实LncRNA LINC00472在口腔肿瘤组织中表达下调，低表达LncRNA LINC00472的口腔肿瘤患者比高表达LncRNA LINC00472的口腔肿瘤患者预后差，因此，将LncRNA LINC00472的表达用于口腔肿瘤患者的预后预测，可以为口腔肿瘤患者的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

Application of in situ hybridization for detection of long chain non coding RNA LINC00472 reagents in oral tumor tissues

The present invention discloses the application of long chain non encoding RNA LINC00472 reagent for detection of oral tumor tissue in situ hybridization, which is used for the preparation of oral cancer patients prognosis preparation, especially the preparation of in situ hybridization detection kit for oral cancer prognosis prediction. The study confirmed the expression of LncRNA LINC00472 in oral tumors reduced, oral tumor patients than the low expression of LncRNA expression of LINC00472 in oral cancer prognosis of patients with LncRNA LINC00472, therefore, the expression of LncRNA LINC00472 for predicting the prognosis of oral cancer patients, can provide a powerful tool for molecular biology and prognosis of oral cancer patients that has far-reaching clinical significance and important application prospect.

【技术实现步骤摘要】
原位杂交检测口腔肿瘤组织中长链非编码RNALINC00472试剂的应用
本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNALINC00472的原位杂交探针的应用方法。
技术介绍
口腔颌面部恶性肿瘤是常见高发的头颈部恶性肿瘤，容易发生颈部淋巴结转移，预后较差。研究表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，其中抑癌基因的失活与癌基因的激活发挥了关键的作用。长链非编码RNAs(longnon-codingRNAs,lncRNAs)是一类长度超过200nt、缺少特异完整的开放阅读框、无或很少有蛋白编码功能的RNAs分子。最近的研究表明，lncRNAs通过在表观遗传、转录和转录后水平广泛调节基因的表达，它们参与了生物体生长、发育、衰老及死亡等重要生命活动的调控。越来越多的研究表明lncRNAs的异常表达或功能缺失与肿瘤的发生发展密切相关。一些lncRNAs分子在肿瘤的诊断和治疗方面具有重要的意义，且可以作为肿瘤预后判断新的分子标记。目前，已经克隆的人类lncRNAs基因已超过4万多个，但绝大部分lncRNA的功能未知。我们检测了LINC00472在临床离体肿瘤样本中的表达水平，并分析了LINC00472表达水平与临床病例资料的相关性。我们从口腔肿瘤及相对应的正常对照组织中抽提RNA后通过逆转录，实时定量PCR，检测了LINC00472的表达情况，结果显示LINC00472在口腔肿瘤组织中表达下调。我们随后又利用原位杂交的方法，进一步在存档石蜡样本验证了LINC00472在口腔肿瘤中表达显著下调，因此针对LINC00472的检测制剂可用于口腔肿瘤的辅助诊断，结合临床回访资料进行生存曲线分析发现LINC00472表达低的患者其生存时间短于该lncRNA表达高的患者，因此针对该lncRNA的检测制剂也可以用于口腔肿瘤的预后判断。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供lncRNALINC00472的原位杂交探针的应用方法，利用LINC00472序列得到的原位杂交探针可以制备用于口腔肿瘤辅助诊断或者预后预测的制剂。原位杂交检测口腔肿瘤组织中长链非编码RNALINC00472的试剂的应用，所述的试剂用于制备口腔肿瘤辅助诊断或者疗效预测制剂；该长链非编码RNALINC00472的序列如SEQNO:1所示。所述的口腔肿瘤辅助诊断或者疗效预测制剂是根据lncRNALINC00472在口腔肿瘤中的表达情况来辅助诊断和疗效预测，口腔肿瘤患者的lncRNALINC00472表达显著下调。所述的原位杂交检测口腔肿瘤组织中长链非编码RNALINC00472的试剂包括以下用于原位杂交检测LINC00472表达的寡核苷酸探针中的一种或几种：LINC00472探针1：5’-CAAAACTAGGATTCTGTCTTTGAGGCAGAC-3’LINC00472探针2：5’-AAGAATGGAAGTGGGAAGAGAGAAAGACTT-3’LINC00472探针3：5’-TAATTCAGGGGTATCCGTCTTAGTTTAGGC-3’。所述的原位杂交检测口腔肿瘤组织中长链非编码RNALINC00472的试剂包括以下阳性对照探针中的一种或几种：GAPDH探针1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'GAPDH探针2：5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3GAPDH探针3：5’-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'。试剂中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂、DAB染色试剂；其它常规生物化学试剂，包括20x柠檬酸钠缓冲溶液(salinesodiumcitrate,SSC)，硫酸葡聚糖(Dextransulphate)，去离子甲酰胺(DeionizedFormamide)，多聚腺苷酸(polyadenylicacid，PolyA)，多聚脱氧腺苷酸(polydeoxyadenylicacid，PolydA)，变性剪切的蛙精DNA(denaturedandshearedsalmonspermDNA，ssDNA)，酵母转运RNA(yeastt-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇(DTT)，50x邓罕氏缓冲液(Denhardts’ssolution)，磷酸缓冲液(PBSbuffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白(BSA)，三乙醇胺(TEA)，醋酸酐，TNB缓冲液(即：pH7.5的0.1MTris-Cl+0.15MNaCl+0.5％阻断试剂)，TNT缓冲液(即：pH7.5的0.1MTris-Cl+0.15MNaCl+0.05％Tween20)。我们通过原位杂交在口腔肿瘤及正常口腔上皮存档石蜡组织标本中发现LINC00472在口腔肿瘤中表达显著下调，且LINC00472的表达与预后密切相关，LINC00472表达低的患者更快地死亡，提示LINC00472可作为口腔肿瘤预后预测的分子标志。本专利技术为口腔肿瘤的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。附图说明图1为利用实时荧光定量PCR的方法检测口腔肿瘤离体样本中LINC00472的表达水平；LINC00472在口腔肿瘤(T)中的表达比正常对照(N)样本中显著下调；图2为原位杂交检测LINC00472在口腔肿瘤及正常口腔粘膜中的表达；左图为正常口腔粘膜组织，右图为口腔肿瘤组织，(放大倍数：200×)，LINC00472在口腔肿瘤中表达水平较低；图3为口腔肿瘤中LINC00472的表达与患者预后的相关性；LINC00472高表达的患者预后比LINC00472低表达或不表达者好，即LINC00472低表达或不表达的患者更快死亡。具体实施方式以下结合具体实施方式进一步说明本专利技术，而非限制本专利技术。实施例1，实时荧光定量法检测证实LINC00472在口腔肿瘤中表达下调1.材料与方法：9例正常口腔粘膜和9例口腔肿瘤组织抽提总RNA，2μgRNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR。LINC00472上游引物为5'-GCATCTGTCAACGCTCCTCT-3'和下游引物5'-CCGCGTTCTTTGTGTGTCTC-3'。用于对照的内参看家基因GAPDH上游引物为5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'和下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，实时荧光定量PCR反应体系实时荧光定量PCR反应步骤反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(thresholdcyclevalues)、内参基因(GAPDH)标化后，采用groupt-test检验计算P值。2.结果LncRNALINC00472在正常对照组织中表达较低，而在口腔肿瘤组织中低表达或者不表达P<0.001(图1)实施例2，原位杂交检测发现LINC00472在口腔肿瘤中的表达与患者预后相关1.材料方法1.1用于口腔肿瘤和正常对照组织原位杂交的寡核苷酸探针根椐LINC00472基因序列分析设计出杂交参数最佳特异性最好的3条寡核苷酸探针，另外，以看家基因GAPDH为阳性对照。用于原位杂交检测LINC0本文档来自技高网...

【技术保护点】
原位杂交检测口腔肿瘤组织中长链非编码RNA LINC00472的试剂的应用，其特征在于，所述的试剂用于制备口腔肿瘤辅助诊断或者疗效预测制剂；该长链非编码RNA LINC00472的序列如SEQ NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.原位杂交检测口腔肿瘤组织中长链非编码RNALINC00472的试剂的应用，其特征在于，所述的试剂用于制备口腔肿瘤辅助诊断或者疗效预测制剂；该长链非编码RNALINC00472的序列如SEQNO:1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的口腔肿瘤辅助诊断或者疗效预测制剂是根据lncRNALINC00472在口腔肿瘤中的表达情况来辅助诊断和疗效预测，口腔肿瘤患者的lncRNALINC00472表达显著下调。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的原位杂交检测口腔肿瘤组织中长链非编码RNALINC00472的试剂包括以下用于原位杂交检测LINC00472表达的寡核苷酸探针中的一种或几种：LINC00472探针1：5’-CAAAACTAGGATTCTGTCTTTGAGGCAGAC-3’LINC00472探针2：5’-AAGAATGGAAGTGGGAAGAGAGAAAGACTT-3’LINC00472探针3：5’-TAATTCAGGGGTATCCGTCTTAGTTTAGGC-3’。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的原位杂交检测口腔肿瘤组织中长链非编码RNALINC00472的试剂包括以下阳性对照探针中的一种或几种：GAPDH探针1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾朝阳，李桂源，熊炜，李小玲，龚朝建，郭灿，张姗姗，王裕民，廖前进，周钰娟，周艳宏，潭怡忻，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43