COX-2在制备诊断、检测犬肿瘤的诊断试剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了COX-2在制备诊断、检测犬肿瘤的诊断试剂中的应用：本发明专利技术通过实验研究发现，COX-2在犬肿瘤(乳腺肿瘤，皮肤及软组织肿瘤，肛周肿瘤，睾丸肿瘤，阴道及子宫肿瘤)中的阳性表达率为76.1％，而在正常组织中的阳性表达率仅为20％，因此，COX-2可以作为犬肿瘤的标志物进行应用，用免疫组织化学方法检测COX-2的表达情况，其结果可以作为是否患有犬肿瘤的临床诊断的依据之一。本发明专利技术还公开了用于检测COX-2的试剂盒(包括3％H2O2溶液、柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液、小鼠COX-2单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG抗体、DAB显色液和蒸馏水)及检测方法(链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶染色)。

【技术实现步骤摘要】
COX-2在制备诊断、检测犬肿瘤的诊断试剂中的应用
本专利技术涉及COX-2作为肿瘤标志物在制备诊断、检测犬肿瘤的诊断试剂中的应用。
技术介绍
环氧酶(cyclo-oxygen-ase，COX)，是前列腺素(PGs)合成所必须的酶，也是PGs合成初始步骤中的关键性限速酶。又称环氧化物水化酶。COX有两种同工酶COX-1和COX-2。前者为结构型被称为要素酶或管家酶，主要存在于血管、胃、肾等组织中，国内外学者普遍认为它产生的PG参与机体正常生理过程和保护功能，如维持胃肠黏膜完整性、调节血小板功能和肾血流；后者为诱导型，是经刺激迅速产生的诱导酶，即由各种损伤性化学、物理和生物因子诱导其产生，进而催化PGs合成参与炎症反应。目前大量动物实验、流行病学、细胞学实验等方面的研究已证实COX-2在人类多种内脏肿瘤，包括胃癌、食管癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌等中存在过表达，因此COX-2与肿瘤的关系也得到了普遍关注，目前认为其致癌机制主要有：刺激细胞增殖、抑制细胞凋亡、抑制机体免疫反应、促进肿瘤新生血管形成、参与致癌物质代谢及增加肿瘤细胞的侵袭性和转移能力等。COX-2与犬肿瘤的关系目前国内没有研究。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术通过实验研究发现，COX-2与犬肿瘤的发生、发展存在着一定的相关性，用免疫组织化学方法检测COX-2的表达情况可以作为临床诊断的依据之一。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术通过实验研究发现，COX-2在犬肿瘤(乳腺肿瘤，皮肤及软组织肿瘤，肛周肿瘤，睾丸肿瘤，阴道及子宫肿瘤)中的阳性表达率为76.1％，而在正常组织中的阳性表达率仅为20％，因此，COX-2可以作为犬肿瘤的标志物进行应用，用免疫组织化学方法检测COX-2的表达情况，其结果可以作为是否患有犬肿瘤的临床诊断的依据之一。尽管COX-2在多种肿瘤中表达，达不到绝对的特异性，但是，所属领域技术人员公知，临床检测指标的特异性的非绝对唯一并不能否定检测指标作为诊断相关疾病的手段之一的可行性，例如医生经常将几种检测指标结合临床表现作出最后诊断。因此，COX-2作为肿瘤标志物具有可行性；尽管COX-2具有非唯一的特异性，但将COX-2作为肿瘤标志物结合其它检测指标及临床表现也足以用于检测犬肿瘤(这种方式也是目前临床上的常见方式)。本专利技术还提供了一种用于诊断、检测犬肿瘤的诊断试剂盒，包括3％H2O2溶液、柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液、小鼠COX-2单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG抗体、DAB显色液和蒸馏水。本专利技术还提供了利用该诊断试剂盒检测COX-2的方法，步骤如下：(1)将待检测组织进行石蜡包埋；石蜡切片，常规脱蜡、水化；(2)3％H2O2溶液室温孵育10分钟；(3)蒸馏水冲洗，PBS缓冲液浸泡5分钟(4)柠檬酸缓冲液微波加热至95～98℃修复抗原10min；(5)PBS缓冲液水洗，加一抗，37℃，湿盒内孵育1h；(6)PBS缓冲液水洗，加二抗，37℃，湿盒内孵育0.25h；(7)PBS缓冲液水洗；(8)滴加新鲜配制DAB显色液，室温孵育20min；(9)蒸馏水充分冲洗；(10)复染、脱水、透明、封片；(11)阴性对照：PBS代替一抗；(12)根据染色结果判断检测结果是否为COX-2阳性，该结果可以作为诊断待检测组织所属患者是否患有犬肿瘤的临床诊断的依据之一。判断检测结果为COX-2阳性的标准为：COX-2阳性染色为棕黄色颗粒，特异性位于细胞浆内及细胞核周；从每张切片中分别观察5个视野，综合分布范围和染色强度进行半定量处理，分布范围按下列标准评分：阳性细胞数为0记为0分；1％-25％为1分；26％-50％为2分；51％-75％为3分；76％-100％为4分；染色强度按下列标准评分：基本不着色为0分；着色淡，但明显强于阴性对照者为1分；着色明显者为2分；着色强者为3分；上述两种评分相加，0～1分为阴性，2分或以上者为阳性。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。下述实施例中所涉及的试剂、方法等，若无特别说明，均为现有技术中的常规试剂、方法。实施例1PAD1作为肿瘤标志物的检测实例收集术后的肿瘤组织46例和在浙江大学附属动物医院解剖的犬正常乳腺、皮肤、睾丸、肛周、子宫组织各3份，去除实质组织上的脂肪部分，用手术剪刀和镊子进行切割，分成大小约1cm3左右的小组织块，用10％的中性福尔马林容易进行固定。所有肿瘤经病理组织切片观察，明确诊断为乳腺肿瘤25例，皮肤及软组织肿瘤11例，肛周肿瘤4例，睾丸肿瘤2例，阴道及子宫肿瘤4例。乳腺肿瘤中复合癌5例，导管乳头状癌3例，实质型癌5例，未分化癌1例，黏液癌1例，纤维肉瘤3例，骨肉瘤1例，复合型腺瘤3例，纤维腺瘤1例，乳腺增生1例；皮肤及软组织肿瘤中基底细胞瘤1例，纤维瘤1例，血管周细胞瘤1例，皮脂腺瘤2例，皮脂腺癌2例，皮脂腺上皮瘤2例，毛母细胞瘤1例，脂肪肉瘤1例；肛周肿瘤中肛周腺瘤1例，肛周腺癌3例；睾丸肿瘤中间质细胞瘤2例；阴道及子宫肿瘤中纤维肉瘤1例，平滑肌瘤2例，平滑肌肉瘤1例。将上述组织包埋的蜡块做另一份切片，进行链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶(SP)染色(该方法为现有技术中已有的成熟的常规技术手段)，所用到的主要试剂如下：一抗为小鼠COX-2单克隆抗体：SantaCruz公司；二抗为山羊抗小鼠IgG抗体：Abbike公司；磷酸盐缓冲液(PBS)：北京方程生物科技有限公司；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒：北京中山生物技术有限公司；SP免疫组化试剂盒：北京中山生物技术有限公司。方法步骤如下：(1)将石蜡切片常规脱蜡、水化；(2)3％(质量百分数)H2O2溶液室温孵育10分钟；(3)蒸馏水冲洗，PBS缓冲液(pH7.4)浸泡5分钟(4)柠檬酸缓冲液(pH6.0)微波加热至95～98℃修复抗原10min；(5)PBS缓冲液水洗，加一抗，37℃，湿盒内孵育1h；(6)PBS缓冲液水洗，加二抗，37℃，湿盒内孵育0.25h；(7)PBS缓冲液水洗；(8)滴加新鲜配制DAB显色液，室温孵育20min；(9)蒸馏水充分冲洗；(10)复染、脱水、透明、封片；(11)阴性对照：PBS代替一抗。本实验用犬的正常乳腺、皮肤、睾丸、肛周、子宫组织作为对照试验。阳性结果判定：COX-2阳性染色为棕黄色颗粒，特异性位于细胞浆内及细胞核周。从每张切片中分别观察5个视野，综合分布范围和染色强度进行半定量处理，分布范围按下列标准评分：阳性细胞数为0记为0分；1％-25％为1分；26％-50％为2分；51％-75％为3分；76％-100％为4分。染色强度按下列标准评分：基本不着色为0分；着色淡，但明显强于阴性对照者为1分；着色明显者为2分；着色强者为3分。上述两种评分相加，0～1分为阴性，2分或以上者为阳性，其中2分为(+)，3～6分为(+++)。应用SPSS13.0软件进行数据分析，不同组COX-2阳性率的表达比较用X2检验，P＜0.05有统计学意义。结果显示：COX-2在犬肿瘤中的阳性表达主要位于肿瘤细胞的胞浆内及胞核周围，为棕黄色颗粒。46例犬肿瘤中30例COX-2呈强阳性表达，5例呈阳性表达，阳性表达率为76.1％(35/46)；15份正常组织中COX-2的阳性表达率为20％(本文档来自技高网...

【技术保护点】
COX‑2在制备诊断、检测犬肿瘤的诊断试剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.COX-2在制备诊断、检测犬肿瘤的诊...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱国，
申请(专利权)人：南京农业大学，朱国，
类型：发明
国别省市：江苏;32