本发明专利技术涉及一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制备方法及其应用，通过培养副溶血弧菌菌种并提取DNA，设计副溶血弧菌外膜蛋白编码序列的引物对，以副溶血弧菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物和载体pET-28a(+)重组转化到E.coli DH5α感受态细胞，将重组载体pET-28a(+)-lptD转化至E.coli BL21感受态细胞中，挑取单克隆摇菌过夜，转接种子液，并在37℃，200r/min下培养至OD600约为0.4后，添加终浓度为1mM的IPTG，继续培养3-4h，以诱导溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白表达，经过纯化最终得到副溶血弧菌外膜蛋白LptD。该副溶血弧菌外膜蛋白具有一定的免疫原性及抗原性，能够有效抵抗副溶血弧菌的感染，以及副溶血弧菌所引起的疾病。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制备方法及其应用，通过培养副溶血弧菌菌种并提取DNA，设计副溶血弧菌外膜蛋白编码序列的引物对，以副溶血弧菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物和载体pET-28a(+)重组转化到E.coli DH5α感受态细胞，将重组载体pET-28a(+)-lptD转化至E.coli BL21感受态细胞中，挑取单克隆摇菌过夜，转接种子液，并在37℃，200r/min下培养至OD600约为0.4后，添加终浓度为1mM的IPTG，继续培养3-4h，以诱导溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白表达，经过纯化最终得到副溶血弧菌外膜蛋白LptD。该副溶血弧菌外膜蛋白具有一定的免疫原性及抗原性，能够有效抵抗副溶血弧菌的感染，以及副溶血弧菌所引起的疾病。【专利说明】一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制备方法及其应用
本专利技术属于生物基因工程
，尤其涉及一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制备方法及其免疫保护功能的应用。
技术介绍
副溶血弧菌(Vibr1 parahaemolyticus)是海水养殖动物的主要病原菌,每年由该菌引起的弧菌病给养殖业造成严重损失，同时副溶血弧菌也是食源性病原菌，对该菌的研究已引起全世界的关注。目前对该菌的预防和治疗主要是依靠抗生素，但因长期大量使用，已引起抗药性，且引起抗生素在动物体内的富集，对人类健康造成危害。近年来的研究表明暴露于副溶血弧菌外表面的外膜蛋白具有一定的免疫原性及抗原性。因此，依赖于外膜蛋白的来研制相应的疫苗来防治细菌性疾病是一种安全有效的方法，与其它防治途径相t匕，以疫苗为主的免疫防治有不可替代的优势。因而利用筛选具高效保护性外膜蛋白，研制亚单位疫苗具有广阔的市场前景。 外膜蛋白(outer membrane proteins, OMPs)是革兰氏阴性菌外膜的主要成分,约占外膜结构的50%。外膜蛋白直接与外环境接触，在维持外膜结构、物质运输、细胞表面识别和信号转导等方面起重要作用，而且某些外膜蛋白可促进细菌粘附和定植、干扰或逃避宿主的免疫防御作用，是病原菌感染以及致病的关键因素之一。近年来的研究已证实某些外膜蛋白具有良好的免疫原性，可促进宿主产生免疫防御反应，是极具发展前景的疫苗靶位。 脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)也称为内毒素,也是革兰氏阴性细菌外膜的主要组分之一，它对于绝大多数革兰氏阴性菌有着至关重要的作用。脂多糖不仅能为这些细菌提供保护，帮助它们抵御恶劣的环境和外界的毒素(包括抗生素)，也是导致炎症和人体天然免疫反应的主要原因，在人体免疫系统对抗细菌入侵时，LPS作为重要的抗原分子被抗原递呈细胞捕获，从而引起机体的免疫反应。目前，脂多糖在细菌胞质中的合成已经有了很深入的了解，但直到近年才发现脂多糖的跨膜转运以及在外膜上的组装由LptA-G蛋白质复合物负责完成。而定位于外膜上的跨膜蛋白LptD (LPS-assembly protein, LPS转运和装配蛋白)通过与外膜脂蛋白LptE相互作用转运脂多糖跨过细菌外膜并组装形成细菌外膜的外小叶。LptD-LptE膜蛋白复合体被认为是革兰氏阴性细菌存活的“命门”。因而LptD对细菌的生理功能和毒力具有关键作用。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制备方法及其免疫保护功能的应用。 本专利技术通过以下技术方案实现: —种副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制备方法，包含以下步骤: I)培养副溶血弧菌菌种并提取DNA ； 2)设计副溶血弧菌外膜蛋白编码序列的引物对，以副溶血弧菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增； 3)PCR产物和载体pET-28a(+)分别进行双酶切、连接后转化到E.coli DH5 α感受态细胞，已含卡那霉素平板进行突变筛选阳性克隆，并对筛选得到的阳性克隆进行PCR、双酶切鉴定及测序分析，以验证成功获得溶血弧菌外膜蛋白LptD基因的重组载体； 4)将重组载体pET_28a(+)-1ptD转化至Ε.coli BL21感受态细胞中； 5)挑取单克隆摇菌过夜，转接种子液，并在37°C，200r/min下培养至0D600约为 0.4后，添加终浓度为ImM的IPTG，继续培养3_4h，以诱导溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白表达； 6)溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白的纯化。 本专利技术所述引物对的核苷酸序列为: 上游引物:5，-CGCCATATGATGCAACATTTCTCC-3，； 下游引物:5’ -CCGCTCGAGTTAATTGTTCAAATAG-3 ’。 步骤⑵和步骤(3)中所述的PCR反应体系均为:10XTaq DNA聚合酶缓冲液5 μ I, 1mM dNTPsly 1，上游引物和下游引物各I μ 1，Taq DNA聚合物I μ 1，模板DNA2 μ 1，超纯水38 μ I，PCR反应体系共50 μ I。 本专利技术所述的溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白的纯化具体为:收集诱导后的菌体，用PBS洗涤后超声破碎后，4°C，12000r/min离心lOmin，弃上清。用1mM的Tris-HCl (pH8.0)、ImM的EDTA、0.5%的Triton X_100、2M尿素洗涤沉淀，重复3次，去除杂蛋白；4°C，12000r/min条件下离心lOmin，取沉淀制样，SDS-PAGE后割胶回收，将胶块碾碎，用萃取液(50mM的 Tris-HCl pH7.9,0.1mM EDTA、150mM NaCl、0.1 % SDS)4°C 萃取过夜，10000r/min 离心15min,取上清装入透析袋,用PBS进行透析,浓缩得到LptD蛋白。 本专利技术提供了副溶血弧菌外膜蛋白LptD作为疫苗组分的应用，所述的疫苗用于抵抗细菌感染，所述的细菌为副溶血弧菌。 本专利技术还提供了副溶血弧菌外膜蛋白LptD在制备抗细菌感染制剂中的应用，所述的细菌为副溶血弧菌。 本专利技术的有益效果为该副溶血弧菌外膜蛋白LptD能有效的保护小鼠免于副溶血弧菌的感染。 【专利附图】【附图说明】 图1是诱导前后的菌体经电泳上样缓冲液处理后的全菌蛋白样品电泳图； 图2是诱导所得菌体经超声破碎后的沉淀和上清液的蛋白样品电泳图； 图3是纯化的LptD蛋白的SDS-PAGE电泳图； 图4是Dot-ELISA法检测免疫小鼠抗血清的效价； 图5是感染副溶血弧菌后对照组及免疫组小鼠的存活率。 【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的
技术实现思路
加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本专利技术的保护范围内。 实施例1 一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制备方法，包含以下步骤: I)培养副溶血弧菌菌种并提取DNA:从平板上挑一个副溶血弧菌单菌落，至5mLLB液体培养基中37°C培养至稳定期；取1.5ml菌液12000rpm离心2min，弃去上清后，用无菌水Iml重悬菌体，洗涤两次，再次离心菌体2min ;弃去上清后本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种副溶血弧菌外膜蛋白LptD的制备方法，其特征在于包含以下步骤：1)培养副溶血弧菌菌种并提取DNA；2)设计副溶血弧菌外膜蛋白编码序列的引物对，以副溶血弧菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增；3)PCR产物和载体pET‑28a(+)分别进行双酶切、连接后转化到E.coli DH5α感受态细胞，已含卡那霉素平板进行突变筛选阳性克隆，并对筛选得到的阳性克隆进行PCR、双酶切鉴定及测序分析，以验证成功获得溶血弧菌外膜蛋白lptD基因的重组载体；4)将重组载体pET‑28a(+)‑lptD转化至E.coli BL21感受态细胞中，挑取单克隆摇菌过夜；5)转接种子液，并在37℃，200r/min下培养至OD600约为0.4后，添加终浓度为1mmol/L的IPTG，继续培养3～4h，以诱导溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白表达；6)溶血弧菌外膜蛋白LptD蛋白的纯化。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：潘建义，李楚楚，叶智鸧，温良优，陈冉，田丽花，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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