本发明专利技术提供一种利用荧光定量PCR技术检测耳聋基因GJB2235delC突变位点的方法及试剂盒。针对GJB2235delC突变位点，设计特异性突变型探针和野生型探针并分别标记不同颜色的荧光，在突变位点两侧设计扩增引物。对一个待测样本用含野生型探针、突变型探针及扩增引物的PCR反应体系进行扩增，通过与质控品比较荧光曲线模式分析样本的基因型，判断样本是否存在GJB2235delC突变。本发明专利技术能为耳聋患者的病因诊断提供有价值的临床参考，也能筛查新生儿、孕期夫妇是否为携带者，为耳聋的产前诊断、新生儿先天耳聋病因诊断提供帮助。本试剂盒具有闭管高通量自动化操作及分析的特点，尤其适合临床实验室使用。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种利用荧光定量PCR技术检测耳聋基因GJB2235delC突变位点的方法及试剂盒。针对GJB2235delC突变位点，设计特异性突变型探针和野生型探针并分别标记不同颜色的荧光，在突变位点两侧设计扩增引物。对一个待测样本用含野生型探针、突变型探针及扩增引物的PCR反应体系进行扩增，通过与质控品比较荧光曲线模式分析样本的基因型，判断样本是否存在GJB2235delC突变。本专利技术能为耳聋患者的病因诊断提供有价值的临床参考，也能筛查新生儿、孕期夫妇是否为携带者，为耳聋的产前诊断、新生儿先天耳聋病因诊断提供帮助。本试剂盒具有闭管高通量自动化操作及分析的特点，尤其适合临床实验室使用。【专利说明】单管荧光PCR技术检测GJB2基因235de IC突变的方法及其 试剂盒
本专利技术属于基因检测
，特别涉及一种探针特异性的实时定量PCR技术检 测耳聋相关基因GJB2 235delC突变的方法及其试剂盒。
技术介绍
耳聋发病率高，目前证实约60%的耳聋由遗传因素引起，由遗传因素引起的耳聋， 30%的患者属于综合征型耳聋6!11)，70%的患者属于非综合征型耳聋（呢!11)。呢!11中 常染色体隐性遗传占75% -80%，即患儿双亲听力正常，但均是致病基因突变的肯定携带 者，多散发存在，目前认为约50%的常染色体隐性遗传性NSHI由GJB2基因突变引起，且不 同种族、地区的人群存在不同的热点致病位点，对于我国，日本，韩国等亚洲人群，235delC 突变位点是GJB2基因的主要致病突变位点，我国的研究资料证实，20-30%的耳聋由GJB2 235delC突变引起，正常听力人群中GJB2 235delC突变的携带者频率为2-3%。因此，临床 上检测GJB2 235delC突变可以明确耳聋病因，进而指导临床；尤其是和新生儿期听力筛查 的同步检测，可以提高新生期耳聋的检出率，提高出生缺陷的三级预防；对孕期/孕前夫妇 进行GJB2 235delC突变检测可以筛查出携带者，进而指导产前诊断，降低耳聋发生率，提 高出生缺陷的二级预防。 目前进行基因突变检测的方法有数十种。金标准法为PCR产物直接测序法。PCR 产物直接测序法是目前应用最广泛、较准确的一种方法，但是该方法需要昂贵的仪器设备 和专业的人员进行操作，费时费力，在临床上很难进行推广。基因芯片法具有快速高通量的 优点，但是操作上复杂，步骤多，成本高也不易普及。以限制性酶切片段长度多态性（RFLP) 检测基因突变的方法具有成本低廉的优点，但是过程烦琐，时间长也不适合普及。公开的 专利（专利号200810222745. 7)采用了等位基因特异PCR技术，在一个PCR反应体系中使 用了 4条引物，对于多位点检测有优势，但是该方法在PCR反应结束后需要后续的凝胶电 泳分析结果，具有开放式操作，凝胶电泳污染环境等缺点，不适合临床推广。相关的专利 201010536373. 2采用引物特异荧光定量PCR扩增法，针对GJB2基因235突变位点设计野 生型引物和突变型引物，对一个待测样本分别用含野生型引物的荧光PCR体系和突变型引 物的荧光PCR体系进行检测，通过比较两次反应的Ct值和两者的差值（ACt)大小，判断样 品是否存在GJB2 235delC突变。该方法具有时间短、高通量、闭管自动化操作、结果分析简 单的优点，适合临床实验室使用，但是存在检测单个位点突变需要2个PCR反应管实现的缺 点。 本方法采用一种采用实时荧光聚合酶链反应技术（FQ-PCR)检测GJB2基因 233-235位点C缺失（235delC)突变方法，针对GJB2基因第235位点碱基缺失处设计特异 性野生型探针及突变型探针，野生型及突变型探针分别被标记上不同颜色的荧光，同时在 GJB2基因第235位点碱基两侧翼序列区设计特异性扩增引物，对于检测样本，依据野生型 与突变型探针在PCR扩增中产生的荧光颜色不同来判断样本是否存在突变。该方法具有时 间短、高通量、闭管自动化操作、结果分析简单，检测单个位点突变需要1个PCR反应管实现 的优点。适合临床实验室使用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种GJB2基因235delC突变的实时荧光定量PCR检测方 法和试剂盒，可用于临床样本的检测。 本专利技术的具体技术路线为： 1)GJB2基因（SEQ ID NO :5)第205-265nt区域设计野生型探针及突变型探针，优 选地，在GJB2基因第215-255nt区域进行探针设计，其长度均为10-30bp之间的核苷酸序 列。两种探针均覆盖GJB2基因233-235nt区域，其中野生型探针（SEQ ID NO :3)针对GJB2 基因235野生型位点，突变型探针（SEQ ID NO :4)针对GJB2基因235delC突变位点。 2)探针5'端标记荧光发生基团FAM或HEX等类似发光基团，3'端标记荧光淬灭 基团TAMRA或BHQ1等类似淬灭基团。探针序列并不局限于本说明书中的具体核苷酸序列， 可以是覆盖GJB2基因235位点的任意一段符合探针要求的核苷酸序列。探针5'端标记的 荧光发生基团及其相应的3'端荧光淬灭基团可以是目前本领域中任何可用的荧光基团，如 FAM，HEX可以由其他荧光基团或染料代替，如VIC，JOE，CY5等。可以使用目前常用的Taqman 探针，也可以是在普通Taqman探针基础上经过修饰的LNA-Taqman探针，MGB-Taqman探针 或现有技术能够在Taqman探针基础上改良修饰的相关探针。 3)GJB2基因第235nt区域上游设计正向扩增引物，在下游设计反向扩增引物，其 长度均为l〇_3〇bp之间的核苷酸序列，能够扩增出含有GJB2基因233-235nt区域的长度为 50-700bp的核苷酸片段，优选地，正向引物（SEQ ID N0:1)及反向引物（SEQ ID N0:2)为 能扩增出含有GJB2基因233-235nt区域60-150bp片段的特异性核苷酸序列。 4)配制适宜于PCR扩增的反应体系。核酸扩增反应体系包括：耐热DNA聚合酶、 dNTP、UNG酶、含有Mg离子的缓冲液，正向引物（SEQ ID N0:1)，反向引物（SEQ ID N0:2)， 野生型探针（SEQ ID NO :3)，突变型探针（SEQ ID NO :4)。 5)从待测样本中提取DNA，加入反应体系，进行荧光定量PCR反应。 6)依据野生型、突变型探针标记的不同颜色显示确定样本的基因型。只有野生型 探针的颜色显示时，样本为野生型，反之为突变型，如果两种颜色都存在，则样本为杂合型。 本专利技术提供的GJB2基因235delC突变检测试剂盒主要包括以下组分：PCR反应 液，阴性质控品，阳性质控品，DNA裂解液，红细胞裂解液和分隔并集中包装这些试剂瓶或管 的包装盒。 本专利技术依据下述原理来实现，为了检测GJB2基因（SEQ ID NO :5)235delC突变， 设计覆盖235位点的突变型探针与野生型探针，野生型探针只能与野生型样本模板完全匹 配，突变型探针只能与突变型样本模板完全匹配，由于突变型探针与野生型探针5'端标记本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用实时荧光聚合酶链反应技术(FQ‑PCR)检测GJB2基因233‑235位点C缺失(235delC)突变的方法，其特征在于以GJB2基因第235位点碱基缺失处设计特异性野生型探针及突变型探针，野生型及突变型探针分别被标记上不同颜色的荧光，同时在GJB2基因第235位点碱基两侧设计特异性扩增引物，对于检测样本，依据野生型与突变型探针在PCR扩增中产生的荧光颜色不同来判断样本是否存在突变。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王宝恒，史桂芝，
申请(专利权)人：王宝恒，
类型：发明
国别省市：山东;37
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