桔小实蝇Taiman基因和其可变剪切体检测方法及其dsRNA技术

本发明专利技术公开了一种桔小实蝇Taiman基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11或12或13或14所示；还公开了扩增桔小实蝇Taiman基因全长的分段扩增引物对，引物序列依次如SEQ ID NO:1～10所示；公开了桔小实蝇Taiman基因的dsRNA、其合成方法及其应用；公开了对桔小实蝇Taiman基因进行qRT‑PCR检测的方法，qPCR中的使用的引物序列分别如SEQ ID NO:27、28所示；还公开了分别对SEQ ID NO:11、12、13、14所示的Taiman基因进行qRT‑PCR检测的方法，引物序列分别如SEQ ID NO:29～36所示。

Taiman gene and its alternative splicing detection method and dsRNA

The invention discloses a Taiman gene, the nucleotide sequence of SEQ ID NO:11 or 12 or 13 or 14; also discloses amplified primer pairs amplified full-length gene primer sequences of Bactrocera Taiman, such as SEQ ID NO:1 in ~ 10 is shown; discloses Taiman gene dsRNA, Bactrocera dorsalis the synthesis method and its application; qRT PCR discloses a method for detection of Taiman gene using the primers of B.dorsalis, sequence in qPCR such as SEQ ID NO:27 respectively, 28 shows; also disclosed are methods of qRT detection of PCR Taiman gene SEQ ID NO:11, 12, 13, 14 as shown, primer sequences such as SEQ ID respectively NO:29 ~ 36 shows.

【技术实现步骤摘要】
桔小实蝇Taiman基因和其可变剪切体检测方法及其dsRNA
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及桔小实蝇Taiman基因和其可变剪切体检测方法及其dsRNA。
技术介绍
桔小实蝇(Bactroceradorsalis)作为我国重要的检疫性害虫，在水果和蔬菜产业方面的危害最为严重，也被认为是我国国际贸易中农产品出口和国内农业的可持续发展中重要的制约因子。桔小实蝇以其寄主范围广、繁殖能力强和世代重叠的特点，使防治的难度大大加大。近年来，主要使用化学防治的方法对于桔小实蝇的治理，虽然简单方便，但长期使用单一药剂，抗药性日益上升为亟待解决的问题。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默手段，是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA，Double-strandedRNA，双链核糖核酸)诱发的、同源RNA高效特异性降解的现象，是通过dsRNA的介导特异性的降解对应序列的mRNA。由于使用RNAi技术可以特异性抑制特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和基因治疗领域。保幼激素(Juvenilehormone,JH)是调控昆虫发育、变态与生殖最重要的激素之一。在昆虫幼虫期，JH阻止由蜕皮激素(Ecdysone)引起的变态，从而使幼虫蜕皮后仍然维持幼虫形态。在幼虫最后一次蜕皮前，JH滴度降低或缺失，导致全变态昆虫化蛹和不完全变态昆虫羽化为成虫。保幼激素在全变态和不全变态昆虫生长发育变态过程中不可或缺，所以保幼激素信号通路Taiman基因的功能研究有利于我们了解保幼激素作用机理。由于人类、高等动物、植物并不含有保幼激素，故保幼激素信号通路基因作为害虫的靶标相对安全，基于该途径研发的新型杀虫剂，应用于害虫的防治具有很大的潜力，但是目前针对桔小实蝇保幼激素通路Taiman基因的相关研究较少，也未见针对桔小实蝇保幼激素信号通路Taiman基因的dsRNA的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种桔小实蝇Taiman基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:11或12或13或14所示。在本专利技术的第一方面，提供一种如SEQIDNO:11或12或13或14所示的桔小实蝇Taiman基因全长的分段扩增引物对，其特征在于，共计5对引物，引物BdTaiS1-F、BdTaiS1-R、BdTaiS2-F、BdTaiS2-R、BdTaiS3-F、BdTaiS3-R、BdTaiS4-F、BdTaiS4-R、BdTaiS5-F、BdTaiS5-R的序列依次如SEQIDNO:1～10所示。在本专利技术的另一方面，提供一种如SEQIDNO:11或12或13或14所示的桔小实蝇Taiman基因的dsRNA，为由序列如SEQIDNO:18所示的核苷酸和与其序列互补的核苷酸组成的双链RNA。本专利技术还提供了SEQIDNO:18所示的桔小实蝇Taiman基因的dsRNA的合成方法，包括如下步骤：提取桔小实蝇的总RNA，反转录成为cDNA作为扩增模板，以序列为SEQIDNO:16的上游引物和以序列为SEQIDNO:17的下游引物进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳后回收产物，以胶回收产物为模板合成得到桔小实蝇Taiman基因的dsRNA。本专利技术还提供了一种如SEQIDNO:11或12或13或14所示的桔小实蝇Taiman基因进行qRT-PCR检测的方法，qPCR中的使用的上下游引物为BdTai-core-F、BdTai-core-R，其序列分别如SEQIDNO:27、28所示。本专利技术还提供了一种针对SEQIDNO:11所示的桔小实蝇Taiman基因进行qRT-PCR检测的方法，qPCR中的使用的上下游引物为BdTaiA-F、BdTaiA-R，其序列分别如SEQIDNO:29、30所示。还提供了一种针对SEQIDNO:12所示的桔小实蝇Taiman基因进行qRT-PCR检测的方法，qPCR中的使用的上下游引物为BdTaiB-F、BdTaiB-R，其序列分别如SEQIDNO:31、32所示。还提供了一种针对SEQIDNO:13所示的桔小实蝇Taiman基因进行qRT-PCR检测的方法，qPCR中的使用的上下游引物为BdTaiC-F、BdTaiC-R，其序列分别如SEQIDNO:33、34所示。还提供了一种针对SEQIDNO:14所示的桔小实蝇Taiman基因进行qRT-PCR检测的方法，qPCR中的使用的上下游引物为BdTaiD-F、BdTaiD-R，其序列分别如SEQIDNO:35、36所示。本专利技术还提供了上述dsRNA在桔小实蝇发育、变态与生殖调节方面的应用，在桔小实蝇防治上的应用，或者在制备桔小实蝇杀虫剂方面的应用。本专利技术的有益效果是：本专利技术运用PCR技术克隆获得桔小实蝇保幼激素信号通路Taiman基因的可变剪切体，并根据可变剪切体的序列得到Taiman基因的dsRNA，可以应用于对桔小实蝇进行RNA干扰从而起到防治桔小实蝇的效果。通过实验验证，dsRNA基因沉默效率高，基因干扰后桔小实蝇有明显表型变化，解决了桔小实蝇目前没有有效的保幼激素信号Taiman基因的dsRNA的问题，在研发新型杀虫剂方面有很好的应用前景。研究结果发现Taiman基因被dsRNA干扰后会缩短桔小实蝇幼虫生长发育进程，使幼虫提前化蛹近24h，除此之外，处理组蛹的体长和体重与对照组相比有显著差异。附图说明图1为扩增桔小实蝇Taiman基因得到的5个可变剪切体进行氨基酸序列相似性比对结果图。图2为桔小实蝇的Taiman基因的氨基酸系统发育树。图3为桔小实蝇注射dsRNA后Taiman基因或注射siTaiman-E后Taiman-E基因的qRT-PCR检测结果，其中A、B为注射dsRNA，C、D为注射siTaiman-E。图4为桔小实蝇注射dsRNA或siTaiman-E后幼虫化蛹时间变化统计图，其中，A为注射dsRNA，B为注射siTaiman-E。图5为桔小实蝇注射dsRNA或siTaiman-E后蛹的表型，其中，A、C、E为注射dsRNA后的蛹的表型，B、D、F为注射siTaiman-E后的蛹的表型。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。主要试剂及生产者：PrimeSTARMaxPremix、PrimeSTARMaxPremix、胶回收纯化试剂盒、PerfectrealtimeRTreagent(Takara公司,日本)TRIzolkit(Invitrogen公司，美国)RNeasyPlusMicroKit(QIAGEN公司，德国)TranscriptAidT7HighYieldTranscriptionKit、TranscriptAidEnzymeMix、ATP/CTP/GTP/UTPMix、PrimeScriptRTEnzymeMixI、OligodTPrimer(ThermofisherScientific公司，美国)qPCRMasterMix(Promega公司，美国)实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一、桔小实蝇Taiman基因可变剪切体序列克隆按照如下步骤操作：1)利用RNA提取试剂盒RNeasyPlusMicroKit按照使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种桔小实蝇Taiman基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11或12或13或14所示。

【技术特征摘要】
1.一种桔小实蝇Taiman基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:11或12或13或14所示。2.扩增权利要求1所述的桔小实蝇Taiman基因全长的分段扩增引物对，其特征在于，共计5对引物，引物BdTaiS1-F、BdTaiS1-R、BdTaiS2-F、BdTaiS2-R、BdTaiS3-F、BdTaiS3-R、BdTaiS4-F、BdTaiS4-R、BdTaiS5-F、BdTaiS5-R的序列依次如SEQIDNO:1～10所示。3.一种权利要求1所述的桔小实蝇Taiman基因的dsRNA，其特征在于，为由序列如SEQIDNO:18所示的核苷酸和与其序列互补的核苷酸组成的双链RNA。4.一种权利要求3所述的桔小实蝇Taiman基因的dsRNA的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：提取桔小实蝇的总RNA，反转录成为cDNA作为扩增模板，以序列为SEQIDNO:16的上游引物和以序列为SEQIDNO:17的下游引物进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳后回收产物，以胶回收产物为模板合成得到桔小实蝇Taiman基因的dsRNA。5.一种对权利要求1所述的桔小实蝇Taiman基因进行qRT-PCR检测的方法，其特征在于，qPCR中的使用的上下游引物为BdTa...

【专利技术属性】
技术研发人员：豆威，王进军，刘鸿，李慧敏，蒋红波，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50