一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒实时荧光RT‑PCR检测试剂盒及其检测方法，专用于蜜蜂以色列急性麻痹病毒的检测。该试剂盒包括：（1）RT‑PCR反应液；（2）Taq DNA聚合酶；（3）反转录酶；（4）阳性标准品；（5）阴性对照；（6）无菌水。本发明专利技术具有以下优点：（1）良好的稳定性和特异性：对蜜蜂以色列急性麻痹病毒的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病毒无交叉反应，且重复性好；（2）灵敏度高：灵敏度能达到10拷贝/μL；（3）操作简便、快速：整个反应可在2小时内完成。本发明专利技术试剂盒可用于蜜蜂以色列急性麻痹病毒的检测及其与其他蜜蜂病毒病的鉴别诊断，对该病的早期预防和及时治疗具有重要意义。

A Real-time Fluorescent RT-PCR Kit for Detecting Apis mellifera Acute Paralysis Virus and Its Detection Method

The invention relates to a real-time fluorescent RT_PCR detection kit for bee acute paralysis virus and a detection method thereof, which is specially used for the detection of bee acute paralysis virus in Israel. The kit includes: (1) RT PCR reaction solution; (2) Taq DNA polymerase; (3) reverse transcriptase; (4) positive standard; (5) negative control; (6) sterile water. The invention has the following advantages: (1) good stability and specificity: the detection of bee acute paralysis virus has high specificity, no cross reaction with other bee viruses, and good repeatability; (2) high sensitivity: sensitivity can reach 10 copies/mu L; (3) simple and fast operation: the whole reaction can be completed in 2 hours. The kit can be used for the detection of bee Israel acute paralysis virus and the differential diagnosis with other bee virus diseases, and has important significance for the early prevention and timely treatment of the disease.

【技术实现步骤摘要】
一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，属于动物卫生
，适用于蜜蜂以色列急性麻痹病毒的检测及其与其他蜜蜂病毒病的鉴别诊断。
技术介绍
以色列急性麻痹病毒(Israeliacuteparalysisvirus，IAPV)是2004年以色列希伯来大学的IlanSela等人发现一种新的病毒，该病毒是正义单链RNA病毒，一个无被膜的二十面体蛋白外壳，归属仿小核糖核酸病毒目(picorna-likevirus)双顺反子病毒科（Dicistroviridae）成员。IAPV可侵染各个发育时期的蜜蜂个体(卵、幼虫、蛹、成蜂)和蜂群各级型蜜蜂（工蜂、雄蜂和蜂王），患病蜜蜂体色变暗，绒毛脱落，伴随翅震颤，逐渐麻痹死亡，会造成蜜蜂的大量损失，对蜜蜂养殖业危害大。IAPV分布广泛，欧洲、南美洲以及亚洲等多个国家都有相关报道。目前，有科学家研究分析，IAPV很可能是导致蜂群崩溃失调病(Colonycollapsedisorder，CCD)主要致病因素之一，会引起蜜蜂的大量消失，蜜蜂损失数量能够达到整个蜂群总数的80%~100%，从而导致严重的授粉危机。我国是世界养蜂大国，养蜂数量和蜂产品产量多年来一直稳居世界首位。养蜂业的稳定发展对于促进农民增收、提高农作物产量和维护生态平衡都具有重要意义。但是，蜜蜂疾病频繁暴发已经成为影响我国养蜂业健康发展的主要因素，其中蜜蜂病毒的危害尤其要引起关注。因此建立一种快速、准确检测IAPV的方法进而防止IAPV的感染至关重要。目前对蜜蜂病毒病的检测主要采用免疫学检测和核酸分子检测技术。免疫检测是目前一种常用的快速检测病毒的方法，但是蜜蜂很多病毒之间具有高度的基因同源性，应用免疫学技术会造成蜜蜂病毒检测特异性较差，很难对蜜蜂病毒病进行准确诊断。基于核酸分子的PCR检测技术与免疫检测技术相比，PCR技术已在病原体检测方面已取得革命性的成功，成为核酸快速检测的一个金标准，具有敏感度高、特异性强、简便、快速而且准确，是目前最常用的，也是实验室主要采用的检测技术之一。实时荧光RT-PCR方法通过利用荧光探针使特异性进一步增强，直接显示扩增结果，而无需电泳检测，更缩短了检测时间。IAPV病症状与蜜蜂急性麻痹病毒（acutebeeparalysisvirus,ABPV)相似，生物学和系统发育学特性与ABPV和蜜蜂克什米尔病毒（Kashmirbeevirus,KBV）都很接近，另外，IAPV、ABPV和KBV这三种病毒核酸序列的同源性都很高，达到65%以上。通过序列比对和分析发现，相对于ABPV、KBV和IAPV的polymerasepolyprotein基因具有比较高的特异性，且该基因针对IAPV相对保守，可以提高方法的特异性。本专利技术利用蜜蜂以色列急性麻痹病毒polymerasepolyprotein基因特异的保守序列设计引物和探针，通过对反应体系的优化，研制用于检测蜜蜂以色列急性麻痹病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒及方法，该方法可在2h内完成IAPV的快速检测。目前，检测蜜蜂以色列急性麻痹病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒及其检测方法未见报道，该技术弥补目前国内有关蜂类疫病检测的技术需求，保护国内蜂群和自然生态的健康发展。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，弥补现有检测技术的不足，其具有特异性强、灵敏度高、操作简单的特点，能够对蜜蜂及其蜂产品中蜜蜂以色列急性麻痹病毒进行快速、准确的检疫和鉴定。为了实现本专利技术的目的，本专利技术的技术方案如下：一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：包括正向引物IAPV-F、反向引物IAPV-R及TaqMan探针IAPV-P，各引物核苷酸序列如下：正向引物IAPV-F：5’-ACTAGTGGACGAAGCGAGTT-3’，反向引物IAPV-R：5’-TGTACTGGGCAGTTACAGCA-3’；TaqMan探针IAPV-P：5’-CGGAACGCCGCATGTGTTACCA-3’，探针的5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和BHQ1进行修饰。其中，该试剂盒的包括以下试剂：（1）RT-PCR反应液：50个反应体系的RT-PCR反应液组成成分为：5×OneStepRNAPCRBuffer250μL，浓度为10μmol/L的正向引物IAPV-F和反向引物IAPV-R各25μL，浓度为5μmol/L的TaqMan探针IAPV-P50μL，浓度为10mmol/L的dNTP25μL，浓度为25mmol/L的MgCl2100μL，浓度为40U/μL的RNaseInhibitor25μL，共计500μL；-20℃保存；（2）TaqDNA聚合酶：25μL浓度为5U/μLTaqDNA聚合酶1支，-20℃保存；（3）反转录酶：25μL浓度为5U/μL反转录酶1支，-20℃保存；（4）阳性标准品：100μL浓度为1×103拷贝/μL的阳性标准品1支，采用含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性标准品，-20℃保存；（5）阴性对照：100μL浓度为100ng/μL的阴性对照1支，采用健康蜜蜂组织提取的总RNA为阴性对照样品，-20℃保存；（6）无菌水：2mL无菌水2支。本专利技术的另一目的在于提供一种使用上述蜜蜂以色列急性麻痹病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：（1）RT-PCR反应体系配置：在PCR管中加入RT-PCR反应液10.0μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，5U/μL反转录酶0.5μL，待测样品RNA2.0μL，然后加入灭菌水12.0μL，使反应总体积为25.0μL；（2）RT-PCR反应程序：42℃反转录15min；95℃预变性3min；然后95℃变性5s、61℃退火延伸30s，共40个循环，在61℃进行单点荧光检测；（3）结果判定：阴性对照无Ct值且无扩增曲线，同时阳性对照Ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验，否则实验无效；在实验有效的情况下，待测样品无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含蜜蜂以色列急性麻痹病毒；待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有蜜蜂以色列急性麻痹病毒；待测样品Ct值＞35，则对该样品重复检测：重复检测结果无Ct值则该样品不含蜜蜂以色列急性麻痹病毒；重复检测结果有Ct值则该样品中含有蜜蜂以色列急性麻痹病毒。本专利技术具有以下优点：（1）良好的稳定性和特异性：本专利技术系选择蜜蜂以色列急性麻痹病毒polymerasepolyprotein基因保守片段为靶目标，不仅设计了一对特异性引物，而且还设计了一条特异性荧光探针，在荧光RT-PCR反应过程中可以对靶目标进行双重控制，对蜜蜂以色列急性麻痹病毒的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病毒无交叉反应，且重复性好；（2）灵敏度高：本专利技术采用TaqMan-BHQ1探针，通过反应体系和反应条件的优化，进一步提升其灵敏度，可达到10拷贝/μL；（3）操作简便、快速：实时荧光收集数据，不需要进行电泳检测核酸的扩增情况，整个反应可在2小时内完成。附图说明图1为实施例1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒实时荧光RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于：包括正向引物IAPV‑F、反向引物IAPV‑R及TaqMan探针IAPV‑P，各引物核苷酸序列如下：正向引物IAPV‑F：5’‑ACTAGTGGACGAAGCGAGTT‑3’；反向引物IAPV‑R：5’‑TGTACTGGGCAGTTACAGCA‑3’；TaqMan探针IAPV‑P：5’‑CGGAACGCCGCATGTGTTACCA‑3’，探针的 5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和BHQ1进行修饰。

【技术特征摘要】
1.一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：包括正向引物IAPV-F、反向引物IAPV-R及TaqMan探针IAPV-P，各引物核苷酸序列如下：正向引物IAPV-F：5’-ACTAGTGGACGAAGCGAGTT-3’；反向引物IAPV-R：5’-TGTACTGGGCAGTTACAGCA-3’；TaqMan探针IAPV-P：5’-CGGAACGCCGCATGTGTTACCA-3’，探针的5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和BHQ1进行修饰。2.根据权利要求1所述的一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括由下列试剂：（1）RT-PCR反应液：50个反应体系的RT-PCR反应液组成成分为：5×OneStepRNAPCRBuffer250μL，浓度为10μmol/L的正向引物IAPV-F和反向引物IAPV-R各25μL，浓度为5μmol/L的TaqMan探针IAPV-P50μL，浓度为10mmol/L的dNTP25μL，浓度为25mmol/L的MgCl2100μL，浓度为40U/μL的RNaseInhibitor25μL，共计500μL；-20℃保存；（2）TaqDNA聚合酶：25μL浓度为5U/μLTaqDNA聚合酶1支，-20℃保存；（3）反转录酶：25μL浓度为5U/μL反转录酶1支，-20℃保存；（4）阳性标准品：100μL浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：张体银，李丹丹，郑腾，张志灯，王武军，邵碧英，于师宇，
申请(专利权)人：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：福建,35