用于检测八种樱桃病毒的RT-PCR试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测八种樱桃病毒的RT‑PCR试剂盒及检测方法，所述RT‑PCR试剂盒中包含独立包装或混装在一起的八对引物，其序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.15所示。本发明专利技术的RT‑PCR试剂盒可以用于田间检测和在种苗脱毒处理后的种苗检测，为樱桃的无毒栽培及物病毒苗木的培育提供技术支持，防治樱桃病毒病的扩散和流行，同时可以提供田间丰富的樱桃病毒的原始资源，为研究樱桃病毒的复制和翻译等分子机制做基础。

RT-PCR Kit for Detecting Eight Cherry Viruses and Its Detection Method

The invention discloses a RT PCR kit for detecting eight cherry viruses and a detection method. The RT PCR kit contains eight pairs of primers packaged independently or mixed together, whose sequences are shown as SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.15, respectively. The RT_PCR kit of the invention can be used for field detection and seedling detection after virus-free treatment of seedlings, providing technical support for cherry virus-free cultivation and virus seedling cultivation, preventing and controlling the spread and epidemic of cherry virus diseases, and providing abundant primitive resources of cherry virus in the field, and laying a foundation for studying molecular mechanisms such as replication and translation of cherry virus.

【技术实现步骤摘要】
用于检测八种樱桃病毒的RT-PCR试剂盒及检测方法
本专利技术涉及植物病毒检测
，具体涉及一种用于检测八种樱桃病毒的RT-PCR试剂盒及检测方法。
技术介绍
樱桃(PrunusaviumL.)为蔷薇科李属樱亚属植物，原产于欧洲，引入中国栽培已有一百多年。樱桃果实外观鲜艳、风味独特、营养丰富，素有“春果第一枝”的美誉。中国自19世纪70年代开始引种栽培甜樱桃，目前栽培面积达到14万hm2，产量约50万吨。樱桃因其抗旱性好、丰产性高、管理简单，投资少等特点，是目前栽培效益最高的果树之一。随着近年来物流运输行业水平的提高，市场逐年扩大，樱桃已经逐渐成为继苹果之后的第二大水果产业。病毒病是当前樱桃种植中的重要病害，樱桃为多年生植物，一旦感染病毒则植株终生带毒，造成持久危害，其危害表现为削弱树势，降低产量；果实畸形，丧失食用价值；导致树体的衰退和死亡。樱桃种苗多采用无性扦插进行扩繁，这是病毒病传播的主要方式之一，地区之间种苗调运频繁，加剧了其扩散和传播，病毒病已成为樱桃产业发展的主要制约因素之一。由于目前樱桃病毒病致病机理尚不清楚，且无有效的化学药物防治，对果园实行严格检疫、对病株及时疏除、选用无病毒砧木和接穗是现阶段最有效的防治措施。因此，建立完善樱桃主要病毒的检测技术体系对于当前樱桃病毒病防治尤为重要。目前国内报道的能够侵染樱桃的病毒有14种，其中广泛发生和造成严重危害的病毒有8种，分别为樱桃病毒A(CherryvirusA,CVA)、樱桃绿环斑驳病毒(Cherrygreenringmottlevirus,CGRMV)、樱桃小果病毒-1(Littlecherryvirus1,LChV-1)、樱桃小果病毒-2(Littlecherryvirus2,LChV-2)、李树皮坏死与茎痘伴随病毒(Plumbarknecrosisstempitting-associatedvirus,PBNSPaV)、李属坏死环斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus,PNRSV)、李矮缩病毒(Prunedwarfvirus,PDV)和黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)。迄今还未见有对上述8种樱桃病毒同时进行检测的报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种用于检测八种樱桃病毒的RT-PCR试剂盒及检测方法。本专利技术的试剂盒可以实现同时检测樱桃病毒A(CherryvirusA，CVA)、樱桃绿环斑驳病毒(Cherrygreenringmottlevirus，CGRMV)、樱桃小果病毒-1(Littlecherryvirus1，LChV-1)、樱桃小果病毒-2(Littlecherryvirus2，LChV-2)、李树皮坏死与茎痘伴随病毒(Plumbarknecrosisstempitting-associatedvirus，PBNSPaV)、李属坏死环斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus，PNRSV)、李矮缩病毒(Prunedwarfvirus，PDV)和黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)这八种侵染樱桃的病毒，提供了一种新的、同时鉴别多种樱桃病毒的快速检测手段。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种用于检测八种樱桃病毒的RT-PCR试剂盒，包含独立包装或混装在一起的如下八对引物：CVA-5838-F：5’-CCAATGTCCACACATGATCC-3’，(SEQIDNO.1)QO-dT：5’-CCAGTGAGCAGAGTGACGTTTTTTTTTTTTTTT-3’；(SEQIDNO.2)CGRM-7474-F：5’-CGGACCCTAAGTCCTCCAAC-3’；(SEQIDNO.3)QO-dT：5’-CCAGTGAGCAGAGTGACGTTTTTTTTTTTTTTTT-3’；(SEQIDNO.2)LCh1-15849-F：5’-TGTTCATGTATAACAAAGGACGTAG-3’；(SEQIDNO.4)LCh1-16827-R：5’-GTTTATGACTAGAGAAGGTAAGCGG-3’；(SEQIDNO.5)LCh2-5670-F：5’-ACTCTGAAAGTGGATCGAGG-3’；(SEQIDNO.6)LCh2-6141-R：5’-GATGTGTGAGAACAAGGCATTC-3’；(SEQIDNO.7)PBN-13568-F：5’-GGATTAGGTGAGGTGTGGTTGAC-3’；(SEQIDNO.8)PBN-14139-R：5’-GTGCATTGCCGATTCCCGGAC-3’；(SEQIDNO.9)PNRS-R3-115-F：5’-GGTTTAGAGATTGTTGGTTGTCTATTC-3’；(SEQIDNO.10)PNRS-R3-1152-R：5’-CAAGAACGGCATCCACCAGC-3’；(SEQIDNO.11)PD-CP-135-F：5’-TTCCGAGTGGATGCTTCACG-3’；(SEQIDNO.12)PD-CP-564-R：5’-CATCGAGTGTTGGAGGTACTGAG-3’；(SEQIDNO.13)CM-R3-119-F：5’-AGGCATGGCTTTCCAAGGTAC-3’；(SEQIDNO.14)CM-R3-768-R：5’-CTGACGGTTTCGTTTGCTCAGC-3’；(SEQIDNO.15)所述八种樱桃病毒分别为CVA、CGRMV、LChV-1、LChV-2、PBNSPaV、PNRSV、PDV和CMV。进一步的，所述RT-PCR试剂盒中还包含：2×TagMasterMix和ddH2O。作为优选，所述RT-PCR试剂盒为多重RT-PCR试剂盒，包含混装在一起的八对引物，所述八对引物的序列分别如SEQIDNO.1-SEQIDNO.15所示；其中，SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12和SEQIDNO.14所示的正向引物的摩尔比为1：1：1：1：1：1：1：1；SEQIDNO.2、SEQIDNO.5、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13和SEQIDNO.15所示的反向引物的摩尔比为2：1：1：1：1：1：1。本专利技术的第二方面，提供上述RT-PCR试剂盒在樱桃病毒检测和/或诊断中的应用。本专利技术的第三方面，提供上述RT-PCR试剂盒在樱桃苗木育种中的应用。本专利技术的第四方面，提供一种同时检测八种樱桃病毒的方法，包括如下步骤：(1)提取待测样品的总RNA，用SEQIDNO.2、SEQIDNO.5、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13和SEQIDNO.15所示的反向引物进行反转录获得样品cDNA；(2)采用上述RT-PCR试剂盒中的八对引物，以样品cDNA为模板进行多重PCR反应，获得扩增产物；(3)对扩增产物进行电泳检测，若扩增产物中出现750bp大小的条带，则样品中含有CVA；若扩增产物中出现900bp大小的条带，则样品中含有CG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测八种樱桃病毒的RT‑PCR试剂盒，其特征在于，包含独立包装或混装在一起的如下八对引物：CVA‑5838‑F：5’‑CCAATGTCCACACATGATCC‑3’，(SEQ ID NO.1)QO‑dT：5’‑CCAGTGAGCAGAGTGACGTTTTTTTTTTTTTTT‑3’；(SEQ ID NO.2)CGRM‑7474‑F：5’‑CGGACCCTAAGTCCTCCAAC‑3’；(SEQ ID NO.3)QO‑dT：5’‑CCAGTGAGCAGAGTGACGTTTTTTTTTTTTTTT‑3’；(SEQ ID NO.2)LCh1‑15849‑F：5’‑TGTTCATGTATAACAAAGGACGTAG‑3’；(SEQ ID NO.4)LCh1‑16827‑R：5’‑GTTTATGACTAGAGAAGGTAAGCGG‑3’；(SEQ ID NO.5)LCh2‑5670‑F：5’‑ACTCTGAAAGTGGATCGAGG‑3’；(SEQ ID NO.6)LCh2‑6141‑R：5’‑GATGTGTGAGAACAAGGCATTC‑3’；(SEQ ID NO.7)PBN‑13568‑F：5’‑GGATTAGGTGAGGTGTGGTTGAC‑3’；(SEQ ID NO.8)PBN‑14139‑R：5’‑GTGCATTGCCGATTCCCGGAC‑3’；(SEQ ID NO.9)PNRS‑R3‑115‑F：5’‑GGTTTAGAGATTGTTGGTTGTCTATTC‑3’；(SEQ ID NO.10)PNRS‑R3‑1152‑R：5’‑CAAGAACGGCATCCACCAGC‑3’；(SEQ ID NO.11)PD‑CP‑135‑F：5’‑TTCCGAGTGGATGCTTCACG‑3’；(SEQ ID NO.12)PD‑CP‑564‑R：5’‑CATCGAGTGTTGGAGGTACTGAG‑3’；(SEQ ID NO.13)CM‑R3‑119‑F：5’‑AGGCATGGCTTTCCAAGGTAC‑3’；(SEQ ID NO.14)CM‑R3‑768‑R：5’‑CTGACGGTTTCGTTTGCTCAGC‑3’；(SEQ ID NO.15)所述八种樱桃病毒分别为CVA、CGRMV、LChV‑1、LChV‑2、PBNSPaV、PNRSV、PDV和CMV。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测八种樱桃病毒的RT-PCR试剂盒，其特征在于，包含独立包装或混装在一起的如下八对引物：CVA-5838-F：5’-CCAATGTCCACACATGATCC-3’，(SEQIDNO.1)QO-dT：5’-CCAGTGAGCAGAGTGACGTTTTTTTTTTTTTTT-3’；(SEQIDNO.2)CGRM-7474-F：5’-CGGACCCTAAGTCCTCCAAC-3’；(SEQIDNO.3)QO-dT：5’-CCAGTGAGCAGAGTGACGTTTTTTTTTTTTTTT-3’；(SEQIDNO.2)LCh1-15849-F：5’-TGTTCATGTATAACAAAGGACGTAG-3’；(SEQIDNO.4)LCh1-16827-R：5’-GTTTATGACTAGAGAAGGTAAGCGG-3’；(SEQIDNO.5)LCh2-5670-F：5’-ACTCTGAAAGTGGATCGAGG-3’；(SEQIDNO.6)LCh2-6141-R：5’-GATGTGTGAGAACAAGGCATTC-3’；(SEQIDNO.7)PBN-13568-F：5’-GGATTAGGTGAGGTGTGGTTGAC-3’；(SEQIDNO.8)PBN-14139-R：5’-GTGCATTGCCGATTCCCGGAC-3’；(SEQIDNO.9)PNRS-R3-115-F：5’-GGTTTAGAGATTGTTGGTTGTCTATTC-3’；(SEQIDNO.10)PNRS-R3-1152-R：5’-CAAGAACGGCATCCACCAGC-3’；(SEQIDNO.11)PD-CP-135-F：5’-TTCCGAGTGGATGCTTCACG-3’；(SEQIDNO.12)PD-CP-564-R：5’-CATCGAGTGTTGGAGGTACTGAG-3’；(SEQIDNO.13)CM-R3-119-F：5’-AGGCATGGCTTTCCAAGGTAC-3’；(SEQIDNO.14)CM-R3-768-R：5’-CTGACGGTTTCGTTTGCTCAGC-3’；(SEQIDNO.15)所述八种樱桃病毒分别为CVA、CGRMV、LChV-1、LChV-2、PBNSPaV、PNRSV、PDV和CMV。2.根据权利要求1所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR试剂盒中还包含：2×TagMasterMix和ddH2O。3.根据权利要求1或...

【专利技术属性】
技术研发人员：原雪峰，曹欣然，于成明，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37