抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC?NO.C2013189的杂交瘤细胞株所分泌的，本发明专利技术还公开了所述单克隆抗体的制备方法和应用。本发明专利技术的单克隆抗体能特异性地与洪湖碘泡虫壳瓣蛋白反应，而不与其它粘孢子虫发生反应，也不与洪湖碘泡虫除壳瓣外的其它结构发生反应，可用于制备特异性检测洪湖碘泡虫的试剂盒，具有检测特异性高，反应灵敏的特点，适用于洪湖碘泡虫的高通量检测。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC?NO.C2013189的杂交瘤细胞株所分泌的，本专利技术还公开了所述单克隆抗体的制备方法和应用。本专利技术的单克隆抗体能特异性地与洪湖碘泡虫壳瓣蛋白反应，而不与其它粘孢子虫发生反应，也不与洪湖碘泡虫除壳瓣外的其它结构发生反应，可用于制备特异性检测洪湖碘泡虫的试剂盒，具有检测特异性高，反应灵敏的特点，适用于洪湖碘泡虫的高通量检测。【专利说明】抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
粘孢子虫(myxosporea)是养殖鱼类常见的寄生虫，能导致养殖鱼类的重大病害发生。其中，洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis Liu et Gu, 2012)是异育银鲫“喉孢子虫病”的病原，经过移行与发育最终在鱼体咽部形成大小不等的孢囊，夺取宿主营养、阻塞鱼体进食和造成机械压迫，最终导致鱼体死亡。多年来，该病在湖北省武汉、仙桃、荆州、黄冈及江苏省盐城等地区大面积暴发，鱼种死亡率超过90%，严重危害了异育银鲫的健康养殖。洪湖碘泡虫成熟胞囊外有一层坚硬的生物膜，一般化学药物很难渗透其中，至今对该病尚无有效的治疗办法。快速和准确地诊断是有效开展“喉孢子虫病”防治的关键。从洪湖碘泡虫的移行与发育过程来看，要想有效防控喉孢子虫病的发生，必须在胞囊形成前作出正确诊断并采取有效措施阻断孢囊形成。但是，目前在养殖生产中最广泛应用的临床诊断法是基于典型病症和光学显微镜观察成熟孢子进行诊断，这种方法诊断成本低，也能作出诊断，但致命缺点是诊断结果严重滞后，即显微镜能见成熟孢子和临床症状出现时胞囊已经形成。因此，建立早期、快速、灵敏的有效诊断技术对异育银鲫“喉孢子病”的防控具有非常重要的意义。随着免疫学的快速发展，免疫学快速诊断技术在生物医学的理论研究和临床诊断等许多领域得到了广泛应用。其中，免疫荧光抗体技术在水产动物疾病诊断上的应用具有灵敏度高、特异性强、定位准确和应用广泛等优点。近年来，粘孢子虫病的早期快速诊断有了长足的发展，国外许多对渔业有重大危害的粘孢子虫均发展了快速免疫诊断技术，如Ceratomyxa shasta、PKX、M.cerebralis 等。然而，粘孢子虫在免疫原`性方面存在属特异性和种特异性，国内外建立的免疫诊断技术及商品检测试剂均只适用于特定种类，如脑粘体虫的免疫荧光诊断技术，只能特异性诊断脑粘体虫，对其他粘孢子虫无法识别。对于严重危害我国异育银鲫的洪湖碘泡虫，目前尚缺乏种特异性的早期诊断技术。因此，急需发展洪湖碘泡虫的种特异性检测技术，为“喉孢子虫病”的早期诊断和防治提供重要的依据，保障异育银鲫养殖业的健康发展。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体。本专利技术的第二个目的是提供能分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术的第三个目的是提供所述单克隆抗体的制备方法。本专利技术的第四个目的是提供所述单克隆抗体的应用。为了解决上述目的，在本专利技术的第一方面，提供了一种抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体对洪湖碘泡虫壳瓣蛋白有特异性。本专利技术中所述的“特异性”是指单克隆抗体对相应抗原或近似抗原物质的识别能力。特异性高，抗原的识别能力就强。因此，上述的单克隆抗体能够特异性识别和结合洪湖碘泡虫壳瓣蛋白。所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC N0.C2013189的杂交瘤细胞株3B7分泌。所述杂交瘤细胞株3B7已保藏在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期:2013年11月15日，分类命名为小鼠杂交瘤细胞(Mouse hybridoma)。所述杂交瘤细胞株3B7是采用洪湖碘泡虫可溶性蛋白作为抗原免疫小鼠得到的，该可溶性蛋白的SDS-PAGE分析如附图1所示。所述可溶性蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对洪湖碘泡虫壳瓣蛋白有特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3B7，从所述杂交瘤细胞株3B7的培养上清液中或从注射所述杂交瘤细胞后的动物腹水中获取所述单克隆抗体。在本专利技术的一个具体实施例中，以洪湖碘泡虫可溶性蛋白作为抗原免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与同系动物的骨髓瘤细胞进行融合。筛选能够产生目的抗体的杂交瘤细胞，进行克隆化培养，并建立杂交细胞株。上述方法仅是示例性的，例如可以用同样的方法免疫其他哺乳动物，将其脾细胞作为免疫细胞。还可以选择适宜的骨髓瘤细胞用于融合，例如用来自大鼠、小鼠或仓鼠的骨髓瘤细胞。免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合可以按照常规方法进行。筛选产生目的抗体的杂交瘤细胞进行单克隆化，得到的产生本专利技术单克隆抗体的杂交瘤细胞株，可以在普通培养基中传代培养或者在液氮中长时间保存。从杂交瘤细胞收集本专利技术的单克隆抗体时，可以从杂交瘤细胞体外培养上清液中获得抗体，或者将杂交瘤细胞注入适宜的哺乳动物并从动物腹水中获取抗体。前一种方法适于获得高纯度的抗体，后一种方法适于大量获取抗体。通过上述方法获得的抗体，可以用常规方法纯化，例如盐析、凝胶过滤、亲和层析等方法。`在本专利技术的第四方面，提供了一种免疫测定法，所述免疫测定法采用上述的抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体。所述免疫测定法是间接酶联免疫吸附法(ELISA)和间接免疫荧光法(IFAT)。本专利技术建立的ELISA和IFAT检测试剂盒，含有本专利技术的单克隆抗体和用于与单克隆抗体结合的标记物(标记物可以是放射性同位素、荧光化合物、生物素和酶等物质)，以及用于检测的其他试剂和缓冲液。对于本领域的技术人员而言，根据本专利技术的内容，利用上述单克隆抗体，制备相应的检测产品，是显而易见的。本专利技术的有益效果在于:I)该单克隆抗体(mAb3B7)可特异地与洪湖碘泡虫反应，而不与其它粘孢子虫发生反应，从而可以进行洪湖碘泡虫的种特异性检测，弥补目前尚无洪湖碘泡虫特异性检测方法之不足，特异性高，反应灵敏。2)该单克隆抗体(mAb3B7)仅特异地与洪湖碘泡虫壳瓣蛋白发生反应，而不与其它结构发生反应。3)本专利技术的免疫试剂盒可用于洪湖碘泡虫的种特异性检测，弥补目前尚无洪湖碘泡虫特异性检测方法之不足，特异性高，反应灵敏，成本低，适于高通量检测和大规模推广应用。【专利附图】【附图说明】图1:抗原(洪湖碘泡虫可溶性蛋白)的SDS-PAGE分析。M:蛋白marker，M.honghuensis:洪湖碘泡虫可溶性蛋白。图2:抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体3B7的免疫印迹分析(Western_blot)。M:蛋白Marker，mAb3B7:单克隆抗体3B7识别的蛋白条带(Mr28000处)。图3:抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体3B7的间接免疫荧光检测(IFAT) Ca,b标尺为20 ii m ;c标尺为10 u m)o a、c:洪湖碘泡虫突光显微镜拍照图；b:洪湖碘泡虫光学显微镜拍照图。【具体实施方式】为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特举以下实施例结合附图详细说明。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。实施例1抗原的制备1.1孢子的分离纯化用剪本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：顾泽茂，贾洛，翟艳花，柳阳，袁军法，秦建华，李丹，郭庆祥，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：