一个用于构建NADH脱氢酶基因家族缺失结核分枝杆菌的重组TM4噬菌体文库及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一个用于构建NADH脱氢酶基因家族缺失结核分枝杆菌的重组TM4噬菌体文库及其应用。本发明专利技术首先提供了一个构建所述重组TM4噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库，所述重组穿梭载体文库包括16个重组穿梭载体，分别插入了结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族16个成员基因两侧的同源臂序列。本发明专利技术为了方便NADH脱氢酶基因功能研究及疫苗开发，构建了一个同源重组噬菌体文库，该文库可以用于结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因敲除，验证基因是否必需基因，构建NADH脱氢酶敲除菌株，用于BCG疫苗优化改良。利用本发明专利技术所述噬菌体文库进行敲除时，敲除特异性好，阳性率高。

A Recombinant TM4 Phage Library for the Construction of NADH Dehydrogenase Gene Family Deleted Mycobacterium Tuberculosis and Its Application

The invention discloses a recombinant TM4 bacteriophage library for constructing a NADH dehydrogenase gene family deleted Mycobacterium tuberculosis and its application. The invention first provides a recombinant shuttle vector library for constructing the recombinant TM4 bacteriophage library. The recombinant shuttle vector library comprises 16 recombinant shuttle vectors, which insert the homologous arm sequences of 16 member genes of the NADH dehydrogenase gene family of Mycobacterium tuberculosis. In order to facilitate the function research of NADH dehydrogenase gene and vaccine development, a homologous recombinant bacteriophage library was constructed. The library can be used to knock out the NADH dehydrogenase gene of Mycobacterium tuberculosis, verify whether the gene is necessary, construct the NADH dehydrogenase knockout strain, and optimize and improve the BCG vaccine. When the phage library of the invention is used for knockout, the knockout specificity is good and the positive rate is high.

【技术实现步骤摘要】
一个用于构建NADH脱氢酶基因家族缺失结核分枝杆菌的重组TM4噬菌体文库及其应用
本专利技术涉及结核病
，更具体地，涉及一个用于构建NADH脱氢酶基因家族缺失结核分枝杆菌的重组TM4噬菌体文库及其应用。
技术介绍
结核病由结核分枝杆菌感染导致，是全世界首屈一指的传染病杀手，每天夺走4500多人的生命。世卫组织对结核病的控制有如下愿景：到2035年使结核病死亡数比2015年降低95％，到2035年使结核病发病率比2015年降低90％，到2035年没有因结核病而面临灾难性费用的受结核病影响家庭。然而，结核病的治疗面临结核分枝杆菌耐药性的严峻挑战，研究结核分枝杆菌致病机理、耐药机制及开发新的抗结核药物刻不容缓。但是研究进展一直不容乐观。结核分枝杆菌NADH脱氢酶家族可分为I型及II型两类。I型NADH脱氢酶包括NuoA、NuoB、NuoC、NuoD、NuoE、NuoF、NuoG、NuoH、NuoI、NuoJ、NuoK、NuoL、NuoM、NuoN14种，对应的Rv编号依次为Rv3145、Rv3146、Rv3147、Rv3148、Rv3149、Rv3150、Rv3151、Rv3152、Rv3153、Rv3154、Rv3155、Rv3156、Rv3157、Rv3158；II型NADH脱氢酶包含NdhA、Ndh两种，对应的Rv编号分别为Rv0392c、Rv1854c。NADH脱氢酶在结核分枝杆菌电子传递链及能量代谢中发挥重要功能，是抗结核药物开发的重要靶点。Ndh、NdhA蛋白氨基酸序列具有高度相似性，能被苯噻嗪抑制，但是二者在结核分枝杆菌中重要程度并不相同，研究显示NdhA敲除后结核分枝杆菌不会受到太大影响而Ndh敲除后结核分枝杆菌生长、耐氧胁迫及毒力都发生明显改变。NuoA-NuoN这14个蛋白中NuoG蛋白研究的较多，目前已经发现NuoG能影响结核分枝杆菌感染巨噬细胞后细胞的自噬、炎症因子的释放及细胞凋亡，影响结核分枝杆菌生长、毒力等，而其他13个蛋白研究相对来说较少，具体功能还有待深入研究。结核分枝杆菌基因敲除是基因研究的常用工具，可以用于研究基因功能、构建敲除菌株并用于疫苗研发等。BCG(MycobacteriumbovisBacillusCalmette-Guérin)是目前唯一通用的预防结核病的疫苗，在此基础上进一步敲除基因来完善疫苗是科研工作者常用的手段，比如有研究将BCGNuoG基因敲除后，发现菌株诱导细胞免疫更强烈，有望改善疫苗安全性及预防效果，Ndh、NdhA及其他13种Nuo蛋白是否可以作为疫苗敲除靶点还是未知。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一个用于构建NADH脱氢酶基因家族缺失结核分枝杆菌的重组TM4噬菌体文库及其应用。本专利技术的第一个目的是提供一个用于构建敲除结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族用噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库。本专利技术的第二个目的是提供构建所述的重组穿梭载体文库所需的引物组合。本专利技术的第三个目的是提供一个用于敲除结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族的噬菌体文库。本专利技术的第四个目的是提供所述重组穿梭载体文库在制备敲除结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族用噬菌体文库中的应用。本专利技术的第五个目的是提供所述噬菌体文库在敲除结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族中的应用。本专利技术的第六个目的是所述噬菌体文库在构建NADH脱氢酶基因家族缺失结核分枝杆菌中的应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：一个用于构建敲除结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族用噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库，所述重组穿梭载体文库包括16个重组穿梭载体，分别插入了结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族16个成员基因两侧的左右同源臂序列，其中，16个成员基因为Rv0392c、Rv1854c、Rv3145、Rv3146、Rv3147、Rv3148、Rv3149、Rv3150、Rv3151、Rv3152、Rv3153、Rv3154、Rv3155、Rv3156、Rv3157、Rv3158。优选地，16个重组穿梭载体中插入的16个成员的基因两侧的左右同源臂序列需要满足以下条件：利用所述重组穿梭载体文库构建的噬菌体文库用于敲除结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族时，所敲除的结核分枝杆菌的Rv0392c、Rv1854c、Rv3145、Rv3146、Rv3147、Rv3148、Rv3149、Rv3150、Rv3151、Rv3152、Rv3153、Rv3154、Rv3155、Rv3156、Rv3157、Rv3158的基因片段依次如SEQ.ID.NO.65～80所示片段。具体的，Rv0392c敲除的片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO：65所示；Rv1854c敲除的片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO：66所示；Rv3145敲除的片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO：67所示；Rv3146敲除的片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO：68所示；Rv3147敲除的片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO：69所示；Rv3148敲除的片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO：70所示；Rv3149敲除的片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO：71所示；Rv3150敲除的片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO：72所示；Rv3151敲除的片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO：73所示；Rv3152敲除的片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO：74所示；Rv3153敲除的片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO：75所示；Rv3154敲除的片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO：76所示；Rv3155敲除的片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO：77所示；Rv3156敲除的片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO：78所示；Rv3157敲除的片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO：79所示；Rv3158敲除的片段核苷酸序列如SEQ.ID.NO：80所示。优选地，构建流程为将16个成员基因两侧的左右同源臂序列插入到p0004S载体中，得到阳性p0004S重组质粒；用限制性内切酶分别酶切穿梭载体和p0004S重组质粒，连接片段，得到重组穿梭载体。优选地，所述穿梭载体为phAE159。一组用于构建以上任一所述的重组穿梭载体文库的引物组合，包含32对引物，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1～64所示。引物与扩增片段的对应关系见表1。表1：以上所述引物组合在制备敲除结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族用噬菌体文库所需重组穿梭载体文库中的应用。进一步，一个用于敲除结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族的噬菌体文库，所述噬菌体文库含有16种噬菌体，分别含有以上任一所述的16个重组穿梭载体，也属于本专利技术的保护范围。优选地，所述噬菌体为TM4噬菌体。另外，以下所述应用也应在本专利技术的保护范围之内：以上任一所述重组穿梭载体文库在制备敲除结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族用噬菌体文库中的应用；以上所述噬菌体文库在敲除结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族中的应用；以上所述噬菌体文库在构建NADH脱氢酶基因家族缺失结核分枝杆菌中的应用。另外，作为一种可选择的优选方案，本专利技术还提供了一种构建所述重组穿梭载体文库(敲除结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族用噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库)的方法，包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一个用于构建敲除结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族用噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库，其特征在于，所述重组穿梭载体文库包括16个重组穿梭载体，分别插入了结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族16个成员基因两侧的左右同源臂序列，其中，16个成员基因为Rv0392c、Rv1854c、Rv3145、Rv3146、Rv3147、Rv3148、Rv3149、Rv3150、Rv3151、Rv3152、Rv3153、Rv3154、Rv3155、Rv3156、Rv3157、Rv3158。

【技术特征摘要】
1.一个用于构建敲除结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族用噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库，其特征在于，所述重组穿梭载体文库包括16个重组穿梭载体，分别插入了结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族16个成员基因两侧的左右同源臂序列，其中，16个成员基因为Rv0392c、Rv1854c、Rv3145、Rv3146、Rv3147、Rv3148、Rv3149、Rv3150、Rv3151、Rv3152、Rv3153、Rv3154、Rv3155、Rv3156、Rv3157、Rv3158。2.根据权利要求1所述的重组穿梭载体文库，其特征在于，16个重组穿梭载体中插入的16个成员的基因两侧的左右同源臂序列需要满足以下条件：利用所述重组穿梭载体文库构建的噬菌体文库用于敲除结核分枝杆菌NADH脱氢酶基因家族时，所敲除的结核分枝杆菌的Rv0392c、Rv1854c、Rv3145、Rv3146、Rv3147、Rv3148、Rv3149、Rv3150、Rv3151、Rv3152、Rv3153、Rv3154、Rv3155、Rv3156、Rv3157、Rv3158的基因片段依次如SEQ.ID.NO.65～80所示片段。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：周亚凤，王绪德，高磊鑫，刘雪宾，李茜茜，李晓恬，潘健昌，李青，申兆兴，
申请(专利权)人：上海晶诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31