乳酸乳球菌MG1363的构建及其在治疗细菌性阴道炎中的应用制造技术

乳酸乳球菌MG1363的构建及其在治疗细菌性阴道炎中的应用。首先通过化学合成人源及鼠源趋化因子CXCL12，又称基质细胞衍生因子‑1(SDF‑1)，属于CXC类趋化因子家族的小分子蛋白。再加入乳酸乳球菌特有的分泌表达穿膜肽SPusp45,构建成pMG36e‑CXCL12重组质粒，之后电转进入乳酸乳球菌MG1363，实现趋化因子CXCL12的分泌表达。通过阴道栓塞给药的方式持续表达趋化因子CXCL12，以实现对细菌性阴道炎的缓解和治疗作用。

Construction of Lactococcus lactis MG1363 and its application in the treatment of bacterial vaginitis

Construction of Lactococcus lactis MG1363 and its application in the treatment of bacterial vaginitis. Firstly, human and mouse chemokines CXCL12, also known as stromal cell derived factor (SDF 1), are synthesized by chemical synthesis. They belong to the family of CXC chemokines. The recombinant plasmid pMG36e CXCL12 was constructed by adding SPusp45, a specific secretory expression peptide of Lactococcus lactis, and then transfected into Lactococcus lactis MG1363 to achieve the secretory expression of chemokine CXCL12. Continuous expression of chemokine CXCL12 by vaginal embolization can alleviate and treat bacterial vaginitis.

【技术实现步骤摘要】
乳酸乳球菌MG1363的构建及其在治疗细菌性阴道炎中的应用
本专利技术涉及乳酸乳球菌MG1363的制备方法及其在细菌性阴道炎中的应用，属于生物制药领域。
技术介绍
趋化因子是一类对白细胞和干细胞具有定向趋化募集作用的小分子多肽类物质，它们的结构及功能相似，绝大多数在氨基酸序列上有4个保守的半胱氨酸，且根据其N端半胱氨酸的数量及间距的不同分为C-、CXC-、CC-及CX3C-4类趋化因子。趋化因子CXCL12又称基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，它有两种形式，SDF-1α/CXCL12a和SDF-1β/CXCL12b。CXCR4是趋化因子CXCLl2的特异性受体，属于G蛋白耦联的跨膜受体家族，与CXCLl2有高度的亲和力，它广泛表达在血液，免疫和中枢神经系统细胞。研究表明CXCL12/CXCR4效应轴主要参与缺血缺氧及损伤组织的修复，人类子宫内膜中CXCL12功能的研究表明：CXCL12可能在内膜增殖、胚胎着床中发挥重要作用，它们不仅能趋化白细胞以及修复细胞募集到创面，而且还能激活这些细胞，并增强它们的功能。因此我们设想可否通过CXCL12能够参与局部炎症反应和组织修复的性质来治疗细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.乳酸乳球菌MG1363的构建，其特征在于,由以下步骤组成：(1)pMG36e‑CXCL12重组质粒构建:PstI‑SPusp45‑CXCL12‑HindIII全序列化学合成获得pUC57‑CXCL12重组质粒；(2)构建pMG36e‑CXCL12重组质粒：A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pMG36e，pUC57‑CXCL12质粒；B酶切：pMG36e，pUC57‑CXCL12酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；

【技术特征摘要】
1.乳酸乳球菌MG1363的构建，其特征在于,由以下步骤组成：(1)pMG36e-CXCL12重组质粒构建:PstI-SPusp45-CXCL12-HindIII全序列化学合成获得pUC57-CXCL12重组质粒；(2)构建pMG36e-CXCL12重组质粒：A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pMG36e，pUC57-CXCL12质粒；B酶切：pMG36e，pUC57-CXCL12酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；C配制2％琼脂糖凝胶电泳，110V电泳45min；在276bp和3600bp左右切胶回收；D酶连：酶连体系如下，总体系10μL，Fragment:Vector＝5：1和10：1，10℃过夜；E：转化由以下步骤组成:a:从-80℃冰箱中取200μLMC1061感受态细胞悬液，冰上解冻；b:加入2μL质粒溶液，质粒浓度不低于200ng/μL，轻轻摇匀，冰上放置30min后；c:42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min；d:向管中加入800μLLB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，离心4000rpm，1min，弃上清800μL，留200μL菌液，混匀；e:将上述菌液摇匀后取200μL涂布于含300ng/μL红霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h，挑取单克隆；F:测序；G:测序成功后，采用OMEGA质粒小提试剂盒提取重组质粒pMG36e-CXCL12，保存备用，步骤同上。2.根据权利要求1所述的乳酸乳球菌MG1363的构建，其特征在于：将所制备的pMG36e-CXCL12通过电转化为乳酸乳球菌MG1363，转化过程由以下步骤组成：A乳酸菌感受态制备：a：取-80℃冻存的乳酸乳球菌MG1363接种于5mL含有5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃过夜培养；b:将获得菌液按照1％接种于含有2.5％Gly和5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃静置培养至菌体OD600值为0.3-0.4，收集备用；c:将以上收集的菌体培养物冰浴10min，4℃离心5000rpm/min，5min；收集菌体；d:沉淀用冰冷的10％蔗糖和10％甘油混合溶液1/10体积清洗两次，4℃离心8000rpm/min，5min，收集沉淀；e:最后沉淀重悬于1/100体积10％蔗糖和10％甘油混合溶液中，冰浴10min后即可使用...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈廷涛，田溥塬，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西,36