一种分枝杆菌启动子库及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分枝杆菌启动子库及其应用，所述分枝杆菌启动子库，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，N代表A、T、C、G中任一种。本发明专利技术针对目前分枝杆菌启动子可选用少，以及因而以此为基础而开发的分子生物学研究工具(表达系统、诱导调控系统等)受限的问题，提供了一种新的分枝杆菌强启动子库。本发明专利技术解决了分枝杆菌启动子数目少、表达强度不理想等问题。本发明专利技术方法制备得到的分枝杆菌启动子库数目较多、表达强度较高、表达强度梯度范围较广。为开发新疫苗和新型分枝杆菌研究工具打基础。础。础。

【技术实现步骤摘要】
一种分枝杆菌启动子库及其应用


[0001]本专利技术涉及分枝杆菌
，具体地，涉及一种分枝杆菌启动子及其应用。

技术介绍

[0002]结核病是由单一致病菌—结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一种广泛存在且在很多情况下可致命的慢性传染病，一直以来严重危害人类健康。根据世界卫生组织发布的《2020年全球结核病报告》显示，2019年，全球新发结核病患者约996万人，发病率为130/10万，30个结核病高负担国家的新发患者数占全球患者总数的86％。自2020年初以来，新冠疫情对人类健康、社会和经济造成了巨大影响，并有可能在2021年及以后持续下去。即使有些影响得到了控制，仍将产生中、长期后果，包括对结核病流行和应对的影响，这一大流行有可能逆转2019年底前结核病所取得的进展。
[0003]由于结核病防治的重大科技瓶颈问题没有解决，致使全球近100年没有结核病预防的新疫苗、没有针对耐药结核病治疗的新药物。而造成这种局面的根本原因，就是由于缺乏有效的生物资源和研究工具，制约了科研人员对结核菌致病分子机制的深入研究。结核分枝杆菌中与免疫和毒力调控相关的蛋白的结构与功能的研究显得更为重要，可为潜在疫苗的设计和药物靶标的筛选提供依据。
[0004]目前，在分枝杆菌中过表达基因常用启动子为Phsp60/70启动子，该启动子在分枝杆菌中组成型表达热休克蛋白，在以此启动子为模板基础上开发了一些蛋白表达载体等等工具。但由于启动子数目较少、表达强度不理想等原因，导致科研工作者能够运用的探索工具也极度缺乏，限制了继续开发新的研究工具及手段，制约对结核菌致病分子机制的深入研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种分枝杆菌启动子库及其应用。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种分枝杆菌启动子库。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一种分枝杆菌启动子。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供一种重组载体。
[0009]本专利技术的第四个目的是提供一种重组菌株。
[0010]本专利技术的第五个目的是提供所述的分枝杆菌启动子在表达分枝杆菌蛋白中的应用。
[0011]本专利技术的第六个目的是提供一种在分枝杆菌中构建不同表达强度的启动子库的方法。
[0012]本专利技术的第六个目的是提供一种表达系统。
[0013]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
[0014]专利技术以分枝杆菌中常用强启动子Phsp60为基础启动子模板，删除多余的、无用的
序列，同时对启动子核心序列进行多位点随机突变，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。由于其启动子序列的核心序列中的18个核苷酸是随机的，其启动子的强度会有差异，这就构成了一个有很多强度不同的启动子组成的库。该启动库中的中的启动子的强度有强有弱，最强的与最弱的启动子的强度差异大，之间的不同启动子按强度排列会形成一个强度梯度，这个梯度范围很大。
[0015]进一步用报告基因eGFP定量表征启动子的相对表达强度，该表征构件将被连接至骨架质粒pMV261(大肠杆菌
‑
分枝杆菌穿梭质粒)，序列信息为SEQ ID NO.2，图谱信息为图1，得到定量表征系统。该定量表征系统被转化至耻垢分枝杆菌或结核分枝杆菌中，通过流式细胞仪或酶标仪测定菌株荧光表达强度，从而相对定量表征启动子库中的各启动子表达强度，技术流程见图2。该分枝杆菌强启动子库可被用于分枝杆菌的表达系统的构建、新型疫苗的开发等领域。
[0016]因此本专利技术要求保护以下内容：
[0017]一种分枝杆菌启动子库，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，N代表A、T、C、G中任一种。
[0018]一种分枝杆菌启动子，其序列为所述的启动子库中的启动子序列。
[0019]优选地，其序列核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。该启动子在分枝杆菌表达体系内启动子活性很强。
[0020]一种重组载体，为含有所述的分枝杆菌启动子的质粒。
[0021]优选地，所述质粒为大肠杆菌
‑
分枝杆菌穿梭质粒。
[0022]更优选地，所述大肠杆菌
‑
分枝杆菌穿梭质粒为pMV261或pMV361。
[0023]一种重组菌株，为含有所述的重组菌株的受体菌。
[0024]优选地，所述受体菌为结核分枝杆菌或耻垢分枝杆菌。
[0025]所述的分枝杆菌启动子在表达分枝杆菌蛋白中的应用，也属于本专利技术的保护范围。
[0026]一种在分枝杆菌中构建不同表达强度的启动子库的方法，构建含有所述的启动子库的表达系统，转入分枝杆菌，定量检测表达效率。
[0027]一种表达系统，其包含所述的启动子库中的启动子序列。
[0028]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0029]本专利技术针对目前分枝杆菌启动子可选用少，以及因而以此为基础而开发的分子生物学研究工具(表达系统、诱导调控系统等)受限的问题，提供了一种新的分枝杆菌强启动子库以及一种启动子活性强的分枝杆菌表达系统启动子。本专利技术解决了分枝杆菌启动子数目少、表达强度不理想等问题。本专利技术方法制备得到的分枝杆菌启动子库数目较多、表达强度较高、表达强度梯度范围较广。为开发新疫苗和新型分枝杆菌研究工具打基础。
附图说明
[0030]图1为分枝杆菌启动子库系统质粒图谱。
[0031]图2为定量表征启动子库技术流程。
[0032]图3为耻垢分枝杆菌菌株的荧光强度检测。
[0033]图4为结核分枝杆菌菌株的荧光强度检测。
具体实施方式
[0034]下面结合说明书附图及具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0035]实施例1分枝杆菌启动子库的设计
[0036]分枝杆菌中常用强启动子Phsp60为基础启动子模板，除多余的、无用的序列，构建启动子库，其中，
[0037]根据文献中(Stover C K,De L,Fuerst T R,et al.New use of BCG for recombinant vaccines[J].Nature,1991,351(6326):456
‑
460.)启动子Phsp60的5
’‑
RACE结果，确定其转录起始位点(TSS)是两个相邻的G。转录起始位点之后至核糖体结合位点(RBS)之间是163个核苷酸，具有温度调控的作用，由于需要构建的是组成型表达启动子，不需要温度调控，因此这163bp是不需要的，进行删除；
[0038]核糖体结合位点之后至翻译起始位点之间是11个核苷酸，为了不影响转录后RNA的结构，保留这11bp的序列；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分枝杆菌启动子库，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，N代表A、T、C、G中任一种。2.一种分枝杆菌启动子，其特征在于，其序列为权利要求1所述的启动子库中的启动子序列。3.一种重组载体，其特征在于，为含有权利要求2所述的分枝杆菌启动子的质粒。4.根据权利于3所述的重组载体，其特在在于，所述质粒为大肠杆菌
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分枝杆菌穿梭质粒。5.根据权利于4所述的重组载体，其特在在于，所述大肠杆菌
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分枝杆菌穿梭质...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭铦，周亚凤，申兆兴，
申请(专利权)人：上海晶诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：