一种抑制匍枝根霉的dsRNA及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种抑制匍枝根霉的dsRNA及其应用。本发明专利技术抑制匍枝根霉的dsRNA序列如SEQ ID NO.1所示，本发明专利技术公开了dsRNA在制备匍枝根霉抑制剂中的应用。本发明专利技术首次提供了匍枝根霉dcl1和p450基因，并选择其非保守区序列作为靶标序列，根据该靶标序列，设计上下游引物，用于扩增靶标序列，并在靶标序列的两端加上T7序列，合成了dsRNA。平板抑菌实验发现，dsRNA能够显著抑制匍枝根霉菌丝的延伸和扩散。向桃体外喷施dsRNA发现，加入dsRNA的桃，其软腐病症状明显减轻，从而达到防治桃软腐病的目的。治桃软腐病的目的。治桃软腐病的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制匍枝根霉的dsRNA及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种抑制匍枝根霉的dsRNA及其应用。

技术介绍

[0002]匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)隶属于毛霉目(Mucorales)、毛霉科(Mucorales)、匍枝根霉属(Rhizopus stolonifer)，是一种强寄生性病原菌，一旦侵入宿主体内，就会迅速生长繁殖。匍枝根霉可以侵染桃、杏、梨、猕猴桃、甜瓜、葡萄、金针菇、甘薯等果蔬，造成软腐病，给农业生产带来了巨大的损失。目前国内外普遍采用酸性硫酸钙、二氧化氯、山梨酸钾等化学杀菌剂来抑制匍枝根霉的生长，但长期使用化学杀菌剂不仅会使微生物产生抗性，而且会危害人体的健康。因此，亟待寻找一种高效、安全和环保的病原菌防治方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种抑制匍枝根霉的dsRNA及其应用，dsRNA能显著抑制匍枝根霉的生长，从而达到防治桃软腐病的目的。
[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种抑制匍枝根霉的dsRNA，其序列如SEQ ID NO.1所示。
[0005]本专利技术还提供一种匍枝根霉抑制剂，包括上述的dsRNA。
[0006]本专利技术还提供上述的dsRNA在制备匍枝根霉抑制剂中的应用。
[0007]本专利技术还提供上述的dsRNA的靶标序列，其序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术还提供上述的dsRNA的靶标序列在制备或筛选抑制匍枝根霉的dsRNA中的应用。
[0009]本专利技术还提供匍枝根霉dcl1和p450基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0010]本专利技术还提供上述的匍枝根霉dcl1和p450基因作为靶标在制备匍枝根霉抑制剂中的应用。
[0011]本专利技术还提供一种防治桃软腐病的方法，包括向桃体外喷施上述的dsRNA或上述的匍枝根霉抑制剂。
[0012]随着分子生物学的快速发展，一种基于特定靶标基因的高效沉默方法
‑
RNAi成为农作物真菌性病害防治的重要手段。RNAi是指在内源性或外源性的双链RNA(double
‑
stranded RNA，dsRNA)介导下，同源mRNA特异性降解，从而导致靶标基因的表达沉默的过程。将dsRNA导入病原菌体内的方法主要分为宿主诱导的基因沉默(Host
‑
induced gene silencing，HIGS)和喷雾诱导的基因沉默(Spray
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induced gene silencing，SIGS)。HIGS是在病原菌宿主植物体内表达能合成靶向病原菌相关基因dsRNA的元件，然后通过跨界传递，将dsRNA效应因子输送至病原菌体内，通过RNAi下调效应抑制病原菌的生长来保护植物免受其害的一种方法。SIGS则是通过直接向植物组织喷洒靶向病原体关键基因的dsRNA制剂
以抑制相关基因表达，从而实现病害防治的目的。SIGS喷咋的RNAi制剂主要成分是dsRNA，无毒无残留，且操作方便、靶向精准，能解决HIGS存在的脱靶效应和转基因植物的安全性问题，更具应用潜力。目前已在部分病虫害防治中得到了使用，实现了病虫害的环境友好型防治。
[0013]本专利技术所达到的有益效果：本专利技术首次提供了匍枝根霉dcl1和p450基因，并选择其非保守区序列作为为靶标序列，根据该靶标序列，设计上下游引物，用于扩增靶标序列，并在靶标序列的两端加上T7序列，合成了dsRNA。平板抑菌实验发现，dsRNA能够显著抑制匍枝根霉菌丝的延伸和扩散。向桃体外喷施dsRNA发现，加入dsRNA的桃，其软腐病症状明显减轻，通过qRT
‑
PCR检测匍枝根霉dcl1和p450基因的表达情况，发现dsRNA处理组能显著抑制匍枝根霉dcl1和p450基因的表达水平，从而达到防治桃软腐病的目的。
附图说明
[0014]图1为本专利技术体外合成dsRNA的检测结果图；
[0015]图2为本专利技术dsRNA对匍枝根霉的离体抑制结果图；
[0016]图3为本专利技术dsRNA对匍枝根霉菌丝抑制效果图；
[0017]图4为本专利技术dsRNA防治桃软腐病结果图；
[0018]图5为通过qRT
‑
PCR检测匍枝根霉dcl1和p450基因的表达情况。
具体实施方式
[0019]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。
[0020]实施例1：匍枝根霉dcl1和p450基因全长cDNA及靶标片段的获得
[0021]用于防治匍枝根霉的靶标由SEQ ID NO.2所示的dcl1基因靶标序列和p450基因靶标序列组成。基于匍枝根霉的基因组数据库，采用生物学信息法对匍枝根霉dcl1和p450基因进行搜索，获得匍枝根霉dcl1和p450基因全长cDNA序列，用Snap Gene Viewer软件得到非保守区序列，即为靶标序列。根据该靶标序列，采用Primer Premier软件设计上下游引物，用于扩增靶标序列。
[0022]扩增靶标序列的引物为：
[0023]dcl1
‑
F：AGGACCTTGGAGTTGT(SEQ ID NO.5)
[0024]dcl1
‑
R：AAACATTGGGATTACG(SEQ ID NO.6)
[0025]p450
‑
F:TCTTACTTGTTGCCAAAC(SEQ ID NO.7)
[0026]p450
‑
R：GTCGCATAAAGGGAGG(SEQ ID NO.8)
[0027]PCR扩增体系为：
[0028]组分用量2
×
Vazyme Lamp Master Mix50μLPrimer F4μLPrimer R4μLTemplate DNA12μLdd H2Oup to 100μL
[0029]按上表体系混合试剂于200μL离心管中，放入PCR仪，PCR设定程序如下：
[0030][0031]PCR产物电泳检测：
[0032]采用琼脂糖凝胶(2％)通过水平电泳槽(120V，25min)分离DNA，用gel red染色液染色凝胶块，并用凝胶成像仪观察扩增片段的大小。
[0033]PCR产物的回收及纯化：
[0034]将大小正确的产物切下，用天根生化科技(北京)有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化DNA，具体步骤如下：
[0035](1)柱平衡步骤：向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
[0036](2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)，放入干净的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抑制匍枝根霉的dsRNA，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种匍枝根霉抑制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的dsRNA。3.权利要求1所述的dsRNA在制备匍枝根霉抑制剂中的应用。4.权利要求1所述的dsRNA的靶标序列，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.2所示。5.权利要求4所述的dsRNA的靶标序列在制备或筛选抑制匍枝...

【专利技术属性】
技术研发人员：张映曈，周宏胜，凌军，李鹏霞，赵欢欢，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：