一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法及应用，属于基因编辑技术领域，包括将敲除试剂使用显微注射的方法注入翘嘴鲌受精卵胚胎中，获得Mstn基因缺失型翘嘴鲌模型，上述敲除试剂包括sgRNA、Cas9蛋白和酚红指示剂，其中sgRNA的序列如SEQ IDNO.1所示。本发明专利技术采用RNP形式通过显微注射直接递送Cas9蛋白和sgRNA到翘嘴鲌的受精卵中，提高了基因编辑效率。显微注射法能够绕过细胞外基质、细胞膜及细胞质等多层屏障，以最直接的方式将sgRNA和Cas9蛋白精确递送到细胞核或细胞质中，因此可以实现对基因编辑的高度控制进而大幅度降低脱靶效应。幅度降低脱靶效应。幅度降低脱靶效应。

【技术实现步骤摘要】
一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法及应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑
，具体涉及一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法及应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9基因编辑技术是一种由sgRNA引导的Cas9核酸酶靶向编辑技术，其操作简便快速，成本低，已广泛用于基因的敲除、插入和敲除。自2013年首次应用于真核细胞的基因编辑以来，以日新月异的速度在不断发展。不仅广泛应用于基因功能的研究和疾病的治疗，还在模式生物中用于快速制备突变个体，研究生长和发育的机制以及遗传学规律，以及重要经济物种优良性状的改良。
[0003]翘嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)是我国重要的淡水名优经济鱼类之一，具有生长快、肉质细嫩等特点，深受江浙沪地区消费者喜食。自1999年人工繁殖突破后，其养殖、饲料、加工等得到快速发展，并在江、浙、沪等省市形成了产值超亿元的产业。然而，目前养殖用翘嘴鲌多数是未经选育的野生种，其潜在遗传优势尚未被充分挖掘，加之盲目繁育、引种、杂交和累代养殖，导致养殖翘嘴鲌出现了生长减慢、小型化等种质衰退或混杂现象，种质改良已成为翘嘴鲌养殖业持续健康发展的迫切需求。
[0004]肌肉生长抑制素(Myostatin，Mstn)，属于转化生长因子超家族成员，其主要功能是作为肌肉生长的负调控因子，抑制成肌细胞分化增殖。自1997年首次在小鼠中克隆到序列以来，目前已在一些哺乳动物和多种鱼类中克隆到Mstn基因。翘嘴鲌Mstn基因由4个外显子和3个内含子组成，末端具有典型的半胱氨酸残基和RIRR蛋白水解位点。本专利技术目的在于突破翘嘴鲌受精卵显微注射和胚胎幼体孵化技术，建立基因编辑技术平台，为功能解析和种质创新提供技术支持。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得基因编辑翘嘴鲌的方法。
[0006]为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
[0007]本专利技术公开了一种靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的sgRNA，序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]优选地，靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的gRNA的递送方法为直接递送Cas9蛋白和sgRNA到翘嘴鲌受精卵，递送形式采用RNP形式。
[0009]Cas9蛋白主要由α
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螺旋识别区域(REC)和具有核酸酶活性区域(NUC)组成。REC区域负责结合gRNA，通过调节结构域的构象可以识别、结合gRNA。NUC区域可与PAM区识别结合并且行使切割DNA的能力。
[0010]与基于质粒和RNA的CRISPR/Cas9相比，Cas9
‑
RNP无需进行蛋白的翻译和表达可以在Cas9蛋白末端的核定位序列(NLS)的帮助下进入细胞核直接进行基因编辑，提高了基因
编辑效率。基因编辑结束后不会产生新的蛋白，这种基因编辑的方式也被认为可以产生最少脱靶效应。
[0011]本专利技术还公开了一种靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂，包括sgRNA、Cas9蛋白和酚红指示剂。
[0012]优选地，靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂中各成分的浓度分别为：Cas9蛋白180
‑
210ng/μL、sgRNA 90
‑
110ng/μL和酚红指示剂0.01
‑
0.1wt％。
[0013]更优选地，靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂中各成分的浓度分别为：Cas9蛋白200ng/μL、sgRNA 100ng/μL和酚红指示剂0.05wt％。
[0014]优选地，敲除试剂还包括水苏碱。显微注射时添加水苏碱可以极大提高胚胎孵化率以及孵化后幼体的成活率。
[0015]更优选地，敲除试剂中水苏碱的浓度为100ng/μL。
[0016]本专利技术还公开了靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂在构建Mstn基因缺失型翘嘴鲌模型中的应用。
[0017]本专利技术还公开了一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法，包括将敲除试剂使用显微注射的方法注射入翘嘴鲌受精卵内，孵化获得Mstn基因缺失型翘嘴鲌模型。
[0018]将CRISPR/Cas9系统递送到细胞内最直接的方法是显微注射法。因为它能够绕过细胞外基质、细胞膜及细胞质等多层屏障，以最直接的方式将sgRNA和Cas9蛋白精确递送到细胞核或细胞质中。这种操作方式从本质上来说是在单细胞水平上的逐个编辑，因此可以实现对基因编辑的高度控制进而大幅度降低脱靶效应。此外，该方法不受CRISPR/Cas9系统的分子量和大小限制，因此在对编码Cas9蛋白和gRNA的大分子量pDNA(>7kb)或直接对Cas9蛋白(160kDa)递送时甚至有着高达100％的效率。
[0019]优选地，每个受精卵给予2.1
‑
2.5nL靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂。
[0020]优选地，受精卵的收集时间为受精卵膜顶起后。
[0021]优选地，适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法还包括基因编辑突变效率检测分析：
[0022]收集注射后的胚胎，提取基因组DNA，基于靶向位点在其两端设计特异性引物，未处理胚胎作为对照，以基因组为模板进行PCR扩增，PCR产物直接进行Sanger测序，比较注射组和对照组的序列峰图，发现Mstn基因敲除组出现叠峰，提示成功对该基因进行编辑，表明成功在翘嘴鲌中建立基因编辑技术。
[0023]优选地，特异性引物序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
[0024]本专利技术还公开了构建Mstn基因缺失型翘嘴鲌模型的方法在构建其他基因缺失型翘嘴鲌模型中的用途。
[0025]本专利技术具有如下优点：
[0026]本专利技术突破了翘嘴鲌受精卵显微注射和胚胎离体孵化技术，建立基因编辑技术平台，为功能解析和种质创新提供技术支持。本专利技术采用RNP形式通过显微注射直接递送Cas9蛋白和sgRNA到翘嘴鲌的受精卵中。Cas9
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RNP无需进行蛋白的翻译和表达可以在Cas9蛋白末端的核定位序列(NLS)的帮助下进入细胞核直接进行基因编辑，提高了基因编辑效率。同时，基因编辑结束后不会产生新的蛋白，这种基因编辑的方式也被认为可以产生最少脱靶效应。显微注射法能够绕过细胞外基质、细胞膜及细胞质等多层屏障，以最直接的方式将
sgRNA和Cas9蛋白精确递送到细胞核或细胞质中。这种操作方式从本质上来说是在单细胞水平上的逐个编辑，因此可以实现对基因编辑的高度控制进而大幅度降低脱靶效应。
附图说明
[0027]图1为翘嘴鲌基因编辑及突变检测技术路线；
[0028]图2为sgRNA序列在翘嘴鲌Mstn基因的具体位置；
[0029]图3为sgRNA序列设计图；
[0030]图4为翘嘴鲌Mstn基因突变检测结果。
具体实施方式
[0031]下面结合附本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的sgRNA，序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的sgRNA，其特征在于，直接递送Cas9蛋白和所述sgRNA到翘嘴鲌受精卵，递送形式采用RNP形式。3.一种靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂，包括权利要求1或2所述的sgRNA、Cas9蛋白和酚红指示剂。4.根据权利要求3所述的靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂，其特征在于，所述敲除试剂中各成分的浓度分别为：Cas9蛋白180
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210ng/μL、sgRNA 90
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110ng/μL和酚红指示剂0.01
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0.1wt％。5.权利要求3所述的靶向翘嘴鲌受精卵Mstn基因的敲除试剂在敲除翘嘴鲌Mstn基因中的应用。6.一种适于翘嘴鲌受精卵Mstn基因敲除的方法，包括将权利要求3所述的敲除...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑建波，陈乐然，贾永义，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：