一个用于构建谷氨酸基因家族缺失结核分枝杆菌的重组TM4噬菌体文库及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一个用于构建谷氨酸基因家族缺失结核分枝杆菌的重组TM4噬菌体文库及其应用。本发明专利技术首先提供了一个构建所述重组TM4噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库，所述重组穿梭载体文库包括19个重组穿梭载体，分别插入了结核分枝杆菌谷氨酸家族19个成员基因两侧的同源臂序列。本发明专利技术构建的重组TM4噬菌体文库可以用于这些基因的敲除，验证这些基因是否是结核分枝杆菌的必需基因，用于构建基因突变替换菌株，用于构建基因敲除突变菌株，临床分离这些基因突变后对突变基因酶活性功能的研究，为结核分枝杆菌氨基酸代谢药物开发提供潜在靶点。

A Recombinant TM4 Phage Library for Mycobacterium tuberculosis with Glutamate Gene Family Deletion and Its Application

The invention discloses a recombinant TM4 phage library for constructing a glutamate gene family deleted Mycobacterium tuberculosis and its application. The invention first provides a recombinant shuttle vector library needed to construct the recombinant TM4 phage library. The recombinant shuttle vector library comprises 19 recombinant shuttle vectors and inserts the homologous arm sequences on both sides of the 19 member genes of the Mycobacterium tuberculosis glutamate family. The recombinant TM4 phage library constructed by the present invention can be used to knock out these genes, verify whether these genes are essential genes of Mycobacterium tuberculosis, construct gene mutation substitution strains, construct gene knockout mutant strains, and study the enzymatic activities of mutant genes after clinical isolation of these gene mutations. The development of Mycobacterium tuberculosis amino acid metabolism provides a potential target.

【技术实现步骤摘要】
一个用于构建谷氨酸基因家族缺失结核分枝杆菌的重组TM4噬菌体文库及其应用
本专利技术涉及结核分枝杆菌
，更具体地，涉及一个用于构建谷氨酸基因家族缺失结核分枝杆菌的重组TM4噬菌体文库及其应用。
技术介绍
结核病是世界性的疾病难题，在感染人体后潜伏期长，生长缓慢，容易产生耐药性，传统的治疗药物包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺等，由于结核分枝杆菌耐药问题，开发新的药物治疗结核病至关重要。结核分枝杆菌的一个重要特点就是含有大量的PE、PPE蛋白，这些蛋白的合成需要大量的脯氨酸、谷氨酸，PE、PPE蛋白家族的功能大部分都不明确，从结核分枝杆菌的脯氨酸、谷氨酸的代谢途径着手寻找抑制其代谢的药物将会从源头上抑制PE、PPE蛋白的合成，大大削弱PE、PPE蛋白的表达，对治疗结核病有很大作用。脯氨酸在细胞的抗逆性过程中发挥重要功能，保护细胞的膜系统，植物、细菌、动物中已有很多发现，脯氨酸代谢过程中鸟氨酸、谷氨酸是脯氨酸合成的前体，抑制鸟氨酸、谷氨酸的利用将会阻止脯氨酸的合成，非常有意思的是我国传统中药紫堇具有治疗肺结核及相关肺部疾病的记载，如《陕西中草药》提到能治肺结核咳血、《贵州草药》提到治疗肺痨咳血等，而在紫堇属深山紫堇中有发现δ-N-乙酰鸟氨酸，δ-N-乙酰鸟氨酸是否是治疗结核病的成分还不清楚，但是已经被证明在昆虫或细菌伤害拟南芥属植物时植物会分泌很多δ-N-乙酰鸟氨酸(AdioAM，2011，Plantcell)，可以看出δ-N-乙酰鸟氨酸是具有杀虫、杀菌作用的，虽然具体机制还不清楚，但是证明了结核分枝杆菌的鸟氨酸、谷氨酸、脯氨酸代谢作为药物研究方向的可能。鸟氨酸、谷氨酸、脯氨酸的合成所需的酶属于谷氨酸家族。谷氨酸家族代谢是否影响PE、PPE蛋白的合成还不清楚，谷氨酸家族基因是否都是必需基因也需要进行验证，谷氨酸家族氨基酸代谢能否作为结核病药物开发方向也需通过相关研究进行论证。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决相关研究问题，构建了一种重组TM4噬菌体文库，可以用于结核分枝杆菌谷氨酸家族基因的敲除，验证这些基因是否是结核分枝杆菌的必需基因，用于构建基因突变替换菌株，用于构建基因敲除突变菌株，临床分离这些基因突变后对突变基因酶活性功能的研究，为结核分枝杆菌氨基酸代谢药物开发提供潜在靶点。本专利技术的第一个目的是提供一个用于构建敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库。本专利技术的第二个目的是提供构建所述的重组穿梭载体文库所需的引物组合。本专利技术的第三个目的是提供一个用于敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因的噬菌体文库。本专利技术的第四个目的是提供所述重组穿梭载体文库在制备敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用噬菌体文库中的应用。本专利技术的第五个目的是提供所述噬菌体文库在敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因中的应用。本专利技术的第六个目的是所述噬菌体文库在构建谷氨酸基因家族缺失结核分枝杆菌中的应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：一个用于构建敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库，所述重组穿梭载体文库包括19个重组穿梭载体，分别插入了结核分枝杆菌谷氨酸家族19个成员基因两侧的左右同源臂序列，其中，19个成员基因为Rv1654、Rv1652、Rv1655、Rv1656、Rv1658、Rv1659、Rv1653、Rv2220、Rv2222c、Rv1878、Rv2860c、Rv2918c、Rv2221c、Rv3859c、Rv3858c、Rv3704c、Rv2427c、Rv2439c、Rv0500。结核分枝杆菌谷氨酸家族相关基因编号及名称如下：优选地，所述19个重组穿梭载体中插入的19个成员的基因两侧的左右同源臂序列需要满足以下条件：利用所述重组穿梭载体文库构建的噬菌体文库用于敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因时，所敲除的结核分枝杆菌的Rv1654、Rv1652、Rv1655、Rv1656、Rv1658、Rv1659、Rv1653、Rv2220、Rv2222c、Rv1878、Rv2860c、Rv2918c、Rv2221c、Rv3859c、Rv3858c、Rv3704c、Rv2427c、Rv2439c、Rv0500的基因片段依次如SEQ.ID.NO.1～19所示片段。具体对应如下：敲除结核分枝杆菌Rv1654基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；敲除结核分枝杆菌Rv1652基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；敲除结核分枝杆菌Rv1655基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；敲除结核分枝杆菌Rv1656基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；敲除结核分枝杆菌Rv1658基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；敲除结核分枝杆菌Rv1659基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；敲除结核分枝杆菌Rv1653基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示；敲除结核分枝杆菌Rv2220基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示；敲除结核分枝杆菌Rv2222c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示；敲除结核分枝杆菌Rv1878基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示；敲除结核分枝杆菌Rv2860c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示；敲除结核分枝杆菌Rv2918c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.12所示；敲除结核分枝杆菌Rv2221c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.13所示；敲除结核分枝杆菌Rv3859c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.14所示；敲除结核分枝杆菌Rv3858c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.15所示；敲除结核分枝杆菌Rv3704c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.16所示；敲除结核分枝杆菌Rv2427c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.17所示；敲除结核分枝杆菌Rv2439c基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.18所示；敲除结核分枝杆菌Rv0500基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.19所示。优选地，构建流程为将19个成员基因两侧的左右同源臂序列插入到p0004S载体中，得到阳性p0004S重组质粒；用限制性内切酶分别酶切phAEB159和p0004S重组质粒，连接片段，得到重组穿梭载体。优选地，所述穿梭载体为phAEB159。更优选地，在所述穿梭载体为phAEB159的插入位置为PacI酶切位点处。同时，本专利技术还提供了一组用于获得所述19个成员的基因两侧的左右同源臂序列的引物组合，包含38对引物，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.20～95所示。引物与扩增片段的对应关系见表1。表1：进一步，本专利技术还提供了一个用于敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因的噬菌体文库，所述噬菌体文库含有19种噬菌体，分别含有上述的19个重组穿梭载体。优选地，所述噬菌体为TM4噬菌体。另外，以下所述应用也应在本专利技术的保护范围之内：所述引物组合在制备敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用噬菌体文库所需重组穿梭载体文库中的应用。所述重组穿梭载体文库在制备敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用噬菌体文库中的应用。所述噬菌体文库在敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因中的应用。所述噬菌体文库在构建谷氨酸基因家族缺失结核分枝杆菌中的应用。另本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一个用于构建敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库，其特征在于，所述重组穿梭载体文库包括19个重组穿梭载体，分别插入了结核分枝杆菌谷氨酸家族19个成员基因两侧的左右同源臂序列，其中，19个成员基因为Rv1654、Rv1652、Rv1655、Rv1656、Rv1658、Rv1659、Rv1653、Rv2220、Rv2222c、Rv1878、Rv2860c、Rv2918c、Rv2221c、Rv3859c、Rv3858c、Rv3704c、Rv2427c、Rv2439c、Rv0500。

【技术特征摘要】
1.一个用于构建敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因用噬菌体文库所需的重组穿梭载体文库，其特征在于，所述重组穿梭载体文库包括19个重组穿梭载体，分别插入了结核分枝杆菌谷氨酸家族19个成员基因两侧的左右同源臂序列，其中，19个成员基因为Rv1654、Rv1652、Rv1655、Rv1656、Rv1658、Rv1659、Rv1653、Rv2220、Rv2222c、Rv1878、Rv2860c、Rv2918c、Rv2221c、Rv3859c、Rv3858c、Rv3704c、Rv2427c、Rv2439c、Rv0500。2.根据权利要求1所述的重组穿梭载体文库，其特征在于，19个重组穿梭载体中插入的19个成员的基因两侧的左右同源臂序列需要满足以下条件：利用所述重组穿梭载体文库构建的噬菌体文库用于敲除结核分枝杆菌谷氨酸家族基因时，所敲除的结核分枝杆菌的Rv1654、Rv1652、Rv1655、Rv1656、Rv1658、Rv1659、Rv1653、Rv2220、Rv2222c、Rv1878、Rv2860c、Rv2918c、Rv2221c、Rv3859c、Rv3858c、Rv3704c、Rv2427c、Rv2439c、Rv0500的...

【专利技术属性】
技术研发人员：周亚凤，王绪德，申兆兴，刘雪宾，
申请(专利权)人：上海晶诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31