无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa及其制备方法技术

本发明专利技术公开了无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa，它是生物安全外源蛋白表达系统，以asd缺失株E.coli 6212/Δasd和alr缺失L. plantarum NC8/Δalr为宿主菌，将来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp. cremoris strain JM4）基因组上P23启动子作为alr基因表达的启动子，以pYA4545，pLP‑1261 Inv，pSIP409PgsA’‑IL‑10，pSIP409PgsA’‑EGFP为基础载体，构建以表面蛋白（S_achoring）为锚定模型的营养互补筛选标记大肠杆菌‑乳酸菌无抗锚定表达载体pLPSa，并以EGFP作为报告基因进行筛选及锚定表达验证。

Non resistant lactobacillus plantarum anchoring expression vector pLPSa and preparation method thereof

The invention discloses an anchored expression vector pLPSa from Lactococcus lactis subsp. cremoris strain JM4, which is a biosafety exogenous protein expression system. The host bacteria are E. coli 6212/asd and L. plantarum NC8/alr deletion strains, and will be derived from P23 on the genome of Lactococcus lactis subsp. cremoris strain JM4. Using pYA4545, pLP_1261 Inv, pSIP409PgsA'IL_10, pSIP40PgsA'EGFP as Because of screening and anchoring expression verification.

【技术实现步骤摘要】
无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa及其制备方法。
技术介绍
植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum，L.plantarum）作为一种肠道宿主菌株可耐受胃内低pH值、高盐的环境，最适生长温度为30-37℃，能耐受10℃左右的低温，但在45℃以上的环境中出现生长抑制，常见于奶油、肉类、蔬菜等制成的发酵食品并可从多数植物中分离得到，故因此得名。研究表明，植物乳杆菌符合美国食品与药品管理局（FDA）的GRAS（GenerallyRecognizedasSafe）规定以及欧洲食品安全局（EFSA）的安全资格认证（QualifiedPresumptionofSafety）标准，通常定殖于人和动物的消化道中并发挥益生作用，利用该菌株制成的微生态制剂能够增强机体免疫力，可有效防止一些胃肠道疾病的发生。同时，该菌株也是良好的外源蛋白表达系统，以其作为口服药用蛋白载体很大程度上解决了蛋白易在消化道中发生水解的问题，从而使多种口服药用蛋白都能有效地发挥防治疾病的作用。pSIP409系列质粒是植物乳杆菌特有的穿梭质粒载体，由于它具备pUC来源于大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）和256rep来源于植物乳杆菌两个复制子，因此它可以在大肠杆菌中复制并在植物乳杆菌中进行外源蛋白的表达。但该系列质粒载体使用了红霉素抗性基因(erythromycin，EM)作为筛选标记，一旦抗性基因转移到宿主染色体内，很可能产生严重的生物安全隐患，因此该系统潜在的应用价值受到了限制。另外，Nguyen等认为红霉素在酸性条件下会发生降解，这对外源基因的诱导表达造成了不利的影响。红霉素也会使菌体产生“生理应激”，从而影响目的基因表达。所以我们要用非抗生素筛选标记代替该载体的抗生素抗性基因并使改建后载体能在受体菌植物乳杆菌NC8/Δalr（L.plantarumNC8/Δalr）中稳定复制表达外源蛋白，从而使我们的乳酸菌制品达到对机体无害要求。丙氨酸消旋酶（AlanineRacemase，alr）基因广泛存在于原核生物基因组中，该基因可将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸，D-丙氨酸是细胞壁中重要的交联成分，是菌株生长的必需物质，因此该酶对原核细胞的生长至关重要。虽然绝大多数微生物都含有两种丙氨酸消旋酶基因：生物合成型（BiosyntheticAlanineRacemase，alr)和代谢型（CatabolicAlanineRacemase，dadx/B），但对于乳酸乳球菌和乳酸杆菌来说，丙氨酸消旋酶由单一alr基因所编码，alr基因缺失株在普通MRS培养基中不生长，只有在额外添加D-丙氨酸的培养基中生长。在选择压力下，带有alr标记的质粒具有较高的稳定性，并且在绝大多数发酵培养基中不会出现D-丙氨酸。大肠杆菌asd基因编码天冬氨酸β-半醛脱氢酶，是二氨基庚二酸(DAP)合成途径中的关键酶，DAP是革兰氏阴性菌细胞壁上肽聚糖的基本成分，asd基因发生缺失突变后，由于不能合成细胞壁而导致溶菌死亡。表层(Surfacelayers)或S-层蛋白(S-layerprotein)，由单一蛋白质或糖蛋白亚单位组成并有规则的排列在细胞膜或细胞壁外，是生物进化过程中最简单的一种生物膜。目前发现乳酸菌的许多种属都含有S-层蛋白，在43-46kDa之间，S-层蛋白表达量高，其启动子的转录效率高，信号肽引导的分泌效率高，被广泛应用于构建高效锚定达载体或分泌表达载。因此利用乳杆菌的S-层蛋白作为携带外源抗原的运载工具，构建出一个良好的乳酸菌锚定表达系统，将抗原定位表达于细胞表面，不仅可以使抗原直接暴露于黏膜，便于免疫辅助成分的参与，也能够减弱抗原的蛋白酶或胃酸降解，加之S-层蛋白的黏附特性及免疫佐剂功能，在利用乳酸菌表达载体构建口服疫苗时无需外加免疫佐剂就可诱发宿主产生免疫保护。
技术实现思路
本专利技术的目的是为解决植物乳杆菌细胞壁厚，外源质粒电转化素宿主菌及植物乳杆菌连接产物筛选阳性重组子困难的问题，而提供一种既能在E.coli6212/Δalr中复制又能在L.plantarumNC8/Δalr中锚定表达的无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa。无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa，它是用NdeI和HindⅢ双酶切pLP-1261Inv和SEQIDNO.1所示的基因，将SEQIDNO.1所示的基因插入pLP-1261Inv，得载体pLPS，再用P23-alr-asd基因替换载体pLPS上红霉素（EM）基因；所述的P23-alr-asd基因，其碱基序列如SEQIDNO.2所示。无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa的制备方法，它包括：1）含有sig_peptide信号肽、S-层蛋白C-末端锚定序列S_achoring基因S制备参照NCBI发布的嗜酸乳杆菌SlpA基因序列，将sig_peptide信号肽序列、S-层蛋白C-末端锚定序列保留，将中间部分基因序列用Linker和多克隆酶切位点SalI、XbaI、XhoI、EcoRI、KpnI替换，Linker和多克隆酶切位点序列为GGCACGATTGCGGCGGTCGACTCTAGACTCGAGGAATTCGGTACC，人工合成SEQIDNO.1所示的基因S；用NdeI和HindⅢ双酶切将SEQIDNO.1所示的基因插入pLP-1261Inv，载体命名为pLPS；2）P23-alr-asd基因制备参照PYA4545载体asd基因序列，NCBI公布的P23启动子和植物乳杆菌alr基因序列将asd基因，P23启动子和alr基因串联，获得P23-alr-asd基因并人工合成（大小3027bp），其碱基序列如SEQIDNO.2所示。3）用P23-alr-asd基因替换载体pLPS上红霉素（EM）基因获得无抗性筛选标记锚定表达载体pLPSa用P23-alr-asd基因替换载体pLPS上红霉素基因，由于载体上没有合适的酶切位点线性化载体，所以采用PCR方法线性化载体和P23-alr-asd基因，参照pLPS基因序列设计引物，扩增去除红霉素基因的5050bp片段LPS，引物如下：LPSF：TTCTATGAGTCGCTTTTTTAAATTTGLPSR：GGATCCCGCACGCATAGCGGTGC扩增P23-alr-asd基因的引物序列如下：asdF：CGCTATGCGTGCGGGATCCTCTTCCCTAAATTTAAATATAAAC（下划线标注的是与pLPS载体上的同源手臂）alrR：CAAATTTAAAAAAGCGACTCATAGAATTAATCTATATAAACTCTCG（与pLPS载体上的同源手臂）；以合成的P23-alr-asd基因为模板扩增含有同源手臂的P23-alr-asd基因，将LPS与P23-alr-asd无缝克隆连接，电转化E.coli6212/Δasd感受态细胞，铺普通LB固体培养基，利用asd基因与宿主菌实现营养互补筛选阳性克隆，测序鉴定正确的质粒命名为pLPSa，并将pLPSa其电转化至得L.plantarumNC8/Δalr，利用alr基因与L.plantarumNC8/Δalr营养互补筛选阳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa，它是用NdeI和HindⅢ双酶切pLP‑1261 Inv和SEQ ID NO.1所示的基因，将SEQ ID NO.1所示的基因插入pLP‑1261 Inv，得载体pLPS，再用P23‑alr‑asd基因替换载体pLPS上红霉素基因；所述的P23‑alr‑asd基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa，它是用NdeI和HindⅢ双酶切pLP-1261Inv和SEQIDNO.1所示的基因，将SEQIDNO.1所示的基因插入pLP-1261Inv，得载体pLPS，再用P23-alr-asd基因替换载体pLPS上红霉素基因；所述的P23-alr-asd基因，其碱基序列如SEQIDNO.2所示。2.无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa的制备方法，它包括：1）含有sig_peptide信号肽、S-层蛋白C-末端锚定序列S_achoring基因S制备参照NCBI发布的嗜酸乳杆菌SlpA基因序列，将sig_peptide信号肽序列、S-层蛋白C-末端锚定序列保留，将中间部分基因序列用Linker和多克隆酶切位点SalI、XbaI、XhoI、EcoRI、KpnI替换，Linker和多克隆酶切位点序列为GGCACGATTGCGGCGGTCGACTCTAGACTCGAGGAATTCGGTACC，人工合成SEQIDNO.1所示的基因S；用NdeI和HindⅢ双酶切将SEQIDNO.1所示的基因插入pLP-1261Inv，载体命名为pLPS；2）P23-alr-asd基因制备参照PYA4545载体asd基因序列，NCBI公布的P23启动子和植物乳杆菌alr基因序列将asd基因，P23启动子和alr基因串联，获得P23-alr-asd基因并人工合成，其碱基序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：王春凤，刘琼，姜延龙，刘永仕，杨桂连，刘晶，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22