蔗糖致死基因SacB在基因缺失反向筛选标记中的应用及其无痕缺失自杀载体制造技术

本发明专利技术涉及一种蔗糖致死基因SacB在基因缺失反向筛选标记中的应用及其无痕缺失自杀载体，本发明专利技术利用sacB基因编码蔗糖果聚糖酶，该酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并且将果糖聚合成高分子量的果聚糖，但高分子量果聚糖积累对细胞存在潜在的毒性作用，可造成细胞死亡。因此利用蔗糖致死基因SacB构建自杀载体，无需通过抗性基因来代替目的基因，避免了抗性标记对下游基因产生任何可能的极性作用，对鸭疫里默氏杆菌基因的功能研究具有重要意义。

Application of sucrose lethal gene SacB in reverse deletion marker for gene deletion and its vector with no trace missing

The present invention relates to the application of sucrose lethal gene SacB in reverse screening marker for gene deletion and its traceless suicide vector. The sacB gene is used to encode sucrose fructanase, which can catalyze the hydrolysis of sucrose to glucose and fructose, and polymerize fructose to high molecular weight fructose but high molecular weight fructose. Accumulation has potential toxic effects on cells, which can cause cell death. Therefore, sucrose lethal gene SacB was used to construct suicide vectors without substituting resistant genes for the target genes, avoiding any possible polar effect of resistance markers on the downstream genes, which is of great significance to the functional study of Riemerella duck plague genes.

【技术实现步骤摘要】
蔗糖致死基因SacB在基因缺失反向筛选标记中的应用及其无痕缺失自杀载体
本专利技术属于生物
，涉及蔗糖致死基因SacB在基因缺失反向筛选标记中的应用，还涉及含有蔗糖致死基因SacB的无痕缺失自杀载体。
技术介绍
基因敲除是研究细菌基因功能的一种重要方法，包括对鸭疫里默氏杆菌基因功能的研究。而基因敲除的方法主要包括由抗性基因介导的有痕缺失，以及由反向筛选基因介导的无痕缺失。目前用于鸭疫里默氏杆菌基因缺失的方法主要是有痕缺失，而有痕缺失会在基因组中留下抗性“疤痕”并导致下游基因的不转录，即“极性效应”。另外，由于鸭疫里默氏杆菌具有多重耐药性，所以用于鸭疫里默氏杆菌有痕缺失的抗性基因的选择范围有限。第三，为防止抗性基因扩散，制备鸭疫里默氏杆菌基因缺失疫苗需要无痕缺失的方法。在此背景下，急需一种无痕缺失的方法来对鸭疫里默氏杆菌基因功能进行研究。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种蔗糖致死基因SacB在作为基因缺失反向筛选标记中的应用；本专利技术的目的之二在于提供含有蔗糖致死基因SacB的无痕缺失自杀载体；本专利技术的目的之三在于提供所述无痕缺失自杀载体在鸭疫里默氏杆菌基因的无痕缺失中的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1.蔗糖致死基因SacB在作为基因缺失反向筛选标记中的应用。2.含有蔗糖致死基因SacB的无痕缺失自杀载体，所述无痕缺失自杀载体由蔗糖致死基因SacB克隆至穿梭质粒pLMF02的NcoI和XhoI酶切位点处，得质粒pLMF02::SacB，然后将复制起始位点pRA0726ori用oriT片段替换。优选的，所述蔗糖致死基因SacB由以下方法制得，以质粒pEX18GM为模板，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示序列为引物进行PCR扩增而得。优选的，所述PCR扩增的条件如下：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，循环30次；最后72℃后延伸7min，16℃保存。优选的，所述oriT片段由以下方法制得：以pEX18GM为模板，以SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示序列为引物进行PCR扩增，得oriT片段。优选的，所述自杀载体中oriT片段通过HindIII和PstI酶切位点替换质粒pLMF02::SacB的复制起始位点pRA0726ori。3.所述无痕缺失自杀载体在鸭疫里默氏杆菌基因的无痕缺失中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术在于提供蔗糖致死基因SacB在作为基因缺失反向筛选标记中的应用，该方法能够简便高效进行基因的无痕缺失，可以用于鸭疫里默氏杆菌基因的功能研究；并且无需通过抗性基因来替代目的基因，避免了抗性标记对下游基因产生任何可能的极性作用；同时还具有生物普遍性，为研究其它细菌的无痕缺失提供了技术参考。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为SacB基因扩增电泳图(M为marker；1为SacB基因)。图2为重组质粒pLMF02::SacB的鉴定结果(A:PCR鉴定结果，1泳道为重组质粒pLMF02::SacB，2泳道为阳性对照；B：双酶切鉴定结果，1泳道为双酶切重组质粒pLMF02::SacB，M为marker)。图3为菌株R.anatipestifeATCCpLMF02和R.anatipestifeATCCpLMF02::SacB对蔗糖的敏感性鉴定结果(1表示R.anatipestifeATCCpLMF02；2表示R.anatipestifeATCCpLMF02::SacB)。图4为克隆oriT基因电泳结果(M为marker；1为oriT基因)。图5为自杀质粒pOBS构建过程。图6为质粒pLMF02::SacB-oriT酶切验证结果(M为marker；1为质粒pLMF02::SacB-oriT)。图7为RA0C_1705基因上游和下游扩增电泳图(1泳道为RA0C_1705的上游扩增片段RA0C_1705up，2泳道为RA0C_1705下游片段RA0C_1705down；M为marker)。图8为RA0C_1705融合片段及酶切验证图(A:RA0C_1705融合片段电泳图，1泳道为RA0C_1705的上游和下游融合片段RA0C_1705up+down；B：酶切回收图，1泳道为进行双酶切后的RA0C_1705up+down，2泳道为双酶切后的质粒pOBS；M为marker)。图9为PCR鉴定融合后的片段与自杀质粒pOBS连接电泳图(1泳道为分离的单克隆DH5αpOBS::RA0C_1705up+down跑出的PCR条带，条带大小在1500bp左右；M为marker)。图10为重组质粒pOBS::RA0C_1705up+down用XhoI单酶切鉴定(1泳道为单酶切空载质粒pOES，2泳道为单酶切重组质粒pOBS::RA0C_1705up+down，M为marker)。图11为鉴定单克隆S17.1pOBS::RA0C_1705up+down(1泳道为分离的单克隆的RA0C_1705up+down全长片段，2泳道为阳性对照ATCC的RA0C_1705up+down全长片段，3泳道为阴性对照。引物为RA0C_1705upP1和RA0C_1705downP2，M为marker)。图12为第一次同源重组的阳性克隆PCR鉴定结果(1泳道为cfx基因片段，2泳道为16SrDNA基因片段，M为marker)。图13为第二次同源重组阳性克隆PCR鉴定结果(A:SacB基因检测结果，泳道1为缺失株RAATCCΔRA0C_1705的SacB，泳道2为SacB阳性对照；B:缺失株RAATCCΔRA0C_1705检测RA0C_1705结果，泳道1为用引物RA0C_1705upP1和RA0C_1705downP2扩增缺失株RAATCCΔRA0C_1705，泳道2为用引物RA0C_1705upP1和RA0C_1705downP2扩增野生株RAATCC11845)。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。本专利技术利用蔗糖致死基因SacB作为一种用于在鸭疫里默氏杆菌R.anatipestife基因缺失中的反向筛选的标记，进而专利技术一种自杀载体并利用此自杀载体专利技术一种无痕缺失的方法。其原理是：sacB基因编码蔗糖果聚糖酶，该酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并且将果糖聚合成高分子量的果聚糖。但高分子量果聚糖积累对细胞存在潜在的毒性作用,可造成细胞死亡。本专利技术以鸭疫里默氏杆菌R.anatipestifeATCCRA0C_1705基因的无痕缺失为例，来说明本专利技术的具体操作方法。实施例1、SacB基因的扩增以质粒pEX18GM(Gene.1998；212(1):77–86)为模板扩增SacB基因，引物为SacBP1：5’-catgccatggcaatgaacatcaaaaagtttgc-3’(SEQIDNO.1)，SacBP2：5’-ccgctcgagttatttgttaactgttaattgtcc-3’(SEQIDNO.2)，反应程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，循环30次；最后72℃后延伸7min，16℃保存。扩增产物进行琼本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蔗糖致死基因SacB在作为基因缺失反向筛选标记中的应用。

【技术特征摘要】
1.蔗糖致死基因SacB在作为基因缺失反向筛选标记中的应用。2.含有蔗糖致死基因SacB的无痕缺失自杀载体，其特征在于：所述无痕缺失自杀载体由蔗糖致死基因SacB克隆至穿梭质粒pLMF02的NcoI和XhoI酶切位点处，得质粒pLMF02::SacB，然后将复制起始位点pRA0726ori用oriT片段替换。3.根据权利要求2所述含有蔗糖致死基因SacB的无痕缺失自杀载体，其特征在于：所述蔗糖致死基因SacB由以下方法制得，以质粒pEX18GM为模板，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示序列为引物进行PCR扩增而得。4.根据权利要求3所述含有蔗糖致死基因SacB的无痕缺失自杀载体，其特征在于：所述PCR扩增的条件如下：98℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘马峰，黄月，罗睿心，程安春，汪铭书，朱德康，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51